Лабораторная работа по дисциплине «Микробиология и иммунология» для Тверская ГСХА

Лабораторная работа № 7   МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ЖИВОТНОВОДСТВА   Цель занятия. Знать показатели, характеризующие качество молока; состав заквасок для различных кисломолочных продуктов. Уметь определять микробную загрязненность молока; кислотность молока и молочных продуктов. Знать показатели, характеризующие качество мяса и яиц. Уметь проводить микроскопические, органолептические и биохимические исследования мяса и яиц на свежесть.   Оборудование и материалы. Обыкновенная простокваша, кефир, сметана, метиленовый голубой, резазурин, электроплитка, водяная баня, термометры, пробирки, 40% раствор КОН, пипетки на 5-10 мл. Пробы мяса различной степени свежести (№1- хорошее, № 2 — испорченное). Пинцеты, скальпели, 2 колбы на 100 мл, универсальный индикатор, реактив Несслера, пробирки, все необходимое для приготовления мазков и их окраски. Три  яйца разной степени испорченности и одно хорошее. Овоскоп.  

1.  Определение микробной загрязненности молока косвенным методом (проба на редуктазу)

  Редуктаза (анаэробная дегидрогеназа) — фермент, который микроорганизмы выделяют в среду. Он обладает редуцирующими (восстановительными) свойствами. Чем больше микроорганизмов в исследуемом продукте, тем больше должно быть фермента. На этом свойстве основано определение загрязнения молока микробами косвенным методом. Проба с индикатором позволяет лишь приблизительно определить количество микробов в молоке.

Ход работы

• Проба с метиленовым голубым

В большие микробиологические пробирки наливают по 1 мл рабочего раствора метиленового голубого и по 20 мл исследуемого молока. Пробирки закрывают резиновыми пробками, смешивают путем медленного переворачивания пробирок и ставят в водяную баню при температуре 38- 40°С. Изменение окраски в молоке учитывают через 20 мин., 2 часа и 5 часов 30 минут (таблица 2).  

Таблица 2 — Разделение молока на классы по времени обесцвечивания в нем метиленового голубого

Класс	Оценка качества молока	Продолжительность обесцвечивания	Количество микробов в 1 мл молока
I II III   IV	Хорошее Удовлетворительное Плохое   Очень плохое	Свыше 5 час. 30 мин. Свыше 2 часа 30 мин. Свыше 20 мин. (до 2 часов) 20 минут и менее	Менее 500 тыс. От 500 тыс. до 4 млн.   От 4 млн. до 20 млн. 20 млн. и выше

  Верхний слой может быть окрашенным, т.к. молоко контактирует с кислородом воздуха, но это в расчет не принимается.  

1.2.  Ускоренная проба с метиленовым голубым

Для постановки ускоренной пробы на редуктазу рабочий раствор метиленового голубого разводят в 10 раз, а количество молока уменьшают в 2 раза. В чистые пробирки наливают по 1 мл разведенного метиленового голубого и вносят по 10 мл молока. Пробирки закрывают резиновыми пробками, перемешивают и ставят в водяную баню, температура которой 38- 40°С, Учет обесцвечивания метиленового голубого в молоке проводят через 5, 10, 15 мин. Молоко, обесцвеченное в течение этого времени, содержит десятки миллионов микроорганизмов в 1 мл, главным образом газообразующих.  

1.3.  Проба с резазуриным

В стерильные пробирки наливают 10 мл исследуемого молока и 1 мл рабочего раствора резазурина. Пробирки закрывают чистыми резиновыми пробками и 3 раза медленно переворачивают, после чего их помещают в водяную баню при температуре 38°С. Учет результатов проводят через 20 мин. и через 1 час. Через 20 минут пробирки с обесцвеченным молоком удаляют, а остальные один раз переворачивают и снова ставят в водяную баню до конца опыта. Качество молока определяют по его обесцвечиванию и окраске с учетом времени (таблица 3).  

2.  Микробиологическое исследование кисломолочных продуктов

Молочнокислые микроорганизмы помимо способности быстро закрашивать молоко, обладают способностью образовывать диацетил и ацетоин, летучие кислоты и эфиры, которые в основном создают аромат кисломолочных продуктов.

Ход работы

• Определение СО₂

В пробирку наливают 20 мл хорошо перемешанной обыкновенной простокваши, отмечают ее уровень и помещают на водяную баню с холодной   водой. Температуру воды в бане поднимают до 90°С и, не вынимая пробирки из бани, отмечают уровень поднятия сгустка. Если в закваске есть СО, сгусток становится губчатым и поднимается над сывороткой на 0,6-3 см и больше. Это указывает на присутствие в простокваше СО₂. Таблица 3 — Определение качества молока по его обесцвечиванию и окраске (проба с резазурином)

Класс	Оценка качества молока	Продолжител ьность изменения цвета	Окраска молока	Количество микробов в 1 мл молока
I II III IV	Хорошее Удовлетворительное Плохое Очень плохое	Через 1 час     Через 1 час     Через 1 час     Через 20 мин.	Сине-стальная     Сиреневая или сине-фиолетовая   Розовая или белая     Белая	Менее 500 тыс.     От 500 тыс. до 4 млн.     От 4 млн. до 20 млн.     Свыше 20 млн.

 

2.2.  Определение ацетоина и диацетила

Три капли фильтрата простокваши смешивают в фарфоровой чашке с тремя каплями 40% раствора КОН. Если в простокваше есть ацетоин и диацетил, через 10-15 мин появляется розовое окрашивание. Окрашивание через 30 мин и позднее не учитывается. Эти методы эффективны, если в закваске не содержится кишечной палочки.

2.3.  Определение кислотности молока

Для титрования берут 10 мл свежего или прокисшего молока, помещают в стакан или колбу, добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1-2 капли фенолфталеина и титруют 0,1н. раствором NaOH при постоянном взбалтывании до появления устойчивой слабо-розовой окраски. Кислотность молока выражают или в процентах молочной кислоты или в градусах Тернера: 1° Т соответствует 1 мл 0,1н. щелочи, пошедшей на титрование 100 мл. Следовательно, если на титрование 10 мл молока пошло Х мл щелочи, то для выражения кислотности молока в градусах Тернера (°Т) нужно Х умножить на 10. Чтобы выразить кислотность в процентах молочной кислоты, следует количество 0,1н. NаОН (в мл), потраченное на титрование 100 мл молока, умножить на 0,009, т.к. 1 мл 0,1н. NaOH нейтрализует эквивалентное количество молочной кислоты. Результаты всех опытов занести в тетрадь и сделать выводы.  

3.  Исследование мяса на свежесть

Определение свежести мяса проводится в сомнительных, спорных случаях оценки доброкачественности, т.е. при первых признаках порчи (ослизнение, гнилостное разложение, загар и т.д.) При этом свежесть мяса устанавливают с помощью комплекса исследований органолептических, биохимических и микроскопических.

Ход работы

• Органолептическое исследование

Органолептическое исследование заключается в определении внешнего вида (наличие корочки подсыхания, ослизнения и т.п.), цвета мяса и жира, консистенции мышечной ткани (путем надавливания тупым твердым предметом), запаха мышечной ткани и жира. Свежее мясо при подсыхании имеет на поверхности сухую корочку бледно-розового или бледно-красного цвета. На разрезе мясо плотное, эластичное, при надавливании шпателем ямка быстро выравнивается, сухожилия упругие, плотные, запах мышечной ткани специфический для каждого вида животного, мясной сок прозрачный. Мясо с частично измененной свежестью (условно годное) — поверхность покрыта заветрившейся корочкой или слизью, липкое, иногда покрыто плесенью. Мясо имеет темный цвет и мутный мясной сок. На разрезе мясо более мягкое и рыхлое, при надавливании ямка выравнивается медленно, запах слегка кислый, затхлый, у жира легкий запах осаливания. Мясо несвежее — поверхность сильно подсохшая или влажная, липкая, часто покрыта плесенью, цвет мяса серый или зеленоватый. На разрезе мышечная ткань дряблая, ямка при надавливании не выравнивается. Явно ощущается гнилостный запах. Жир имеет прогорклый запах, цвет серый и мажущуюся консистенцию.  

3.2.  Микробиологическое исследование мазков-отпечатков

Микроскопическое исследование мяса проводят для определения загрязненности, микробов-возбудителей разных болезней и пригодности его в пищу. На предметном стекле делают два отпечатка из пробы мяса № 1 и № 2„для этого стерильным пинцетом кусочек мяса прикладывают к поверхности обезжиренного предметного стекла. Препараты отпечатки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают по Граму и микроскопируют (90Х). Свежее мясо — отпечатка тканей мяса на стекле почти нет, окраска мазка незаметна. При микроскопировании видны единичные кокки и палочки. Мясо условно годное — мазки-отпечатки окрашены удовлетворительно, так как тканевый сок содержит больше плотных веществ (начало распада тканей). В поле зрения видны кокки и небольшое число палочек. Мясо несвежее — мазки сильно окрашены, так как к стеклу пристает большое количество распавшейся ткани. В поле зрения много палочек и   кокков. При сильном разложении кокки почти отсутствуют, в поле зрения палочковидные формы микробов.  

3.3.  Биохимическое исследование

Наряду с микробами в мясе могут быть продукты их жизнедеятельности.

3.3.1. Определение рН мяса

Отвешивают 10 г мяса, мелко нарезают и заливают 100 мл дистиллированной воды, энергично встряхивают. Через 15 минут фильтруют через бумажный фильтр. В вытяжке определяют рН универсальным индикатором. В свежем мясе рН достигает 5,9-6,2 В условно годном —                 6,4 В непригодном —                     6,5 и выше.

• Определение аммиака реактивом Несслера (капельный метод)

Реакцию ставят в трех пробирках: в одну поливают 1 мл мясного фильтра из пробы № 1; во вторую — 1 мл фильтрата из пробы мяса № 2, в третью — 1 мл дистиллированной воды (контроль). Реактив Несслера вносят в пробирки по каплям. Изменение цвета и появление осадка учитывают после добавления каждой капли (таблица 4). Таблица 4 — Определение качества мяса по реакции на аммиак с реактивом Несслера (по В.Ю. Вольферцу)

Число капель реактива	Изменение цвета и выпадение осадка	Примерное содержание аммиака, мг%	Качество мяса
10     10       10     6 – 9         1 — 5	Цвет не меняется, помутнения и осадка нет   Пожелтение и слабое помутнение, осадка нет     Пожелтение, слабое помутнение и слабый осадок   Пожелтение или оранжевый оттенок и осадок       Резкое пожелтение или оранжево-красный цвет и осадок	До 16     16 – 20       21 – 30     31 – 45         более 45	Свежее     Начальная стадия порчи, мясо подлежит немедленной реализации   — « –     Условно годное, немедленная реализация после зачистки подозрительных участков.   Негодное, подлежит технической утилизации.

Результаты всех исследований заносят в тетрадь.  

4.  Определение свежести яиц

  Микробы попадают в яйцо не только во время его формирования, но и при хранении. С поверхности яйцо защищено скорлупой, которая имеет поры диаметром от 4 до 10 мкм. Через поры микробы проникают внутрь яйца. Особенно этому способствует повышенная влажность и температура. Белок яйца — хорошая среда для развития микроорганизмов. Чаще поражаются старые яйца, в которых во время хранения понижаются защитные силы, нейтрализуется лизоцим. Свежие яйца обладают естественным иммунитетом. Развитие микробов в белке яиц ведет к порче продукта. Высокая влажность и температура способствуют проникновению в яйцо плесневых грибов. Образующиеся в яйце колонии не пропускают свет, их больше всего около воздушной камеры. Гифы гриба образуют густую сеть, выделяют продукты жизнедеятельности. Белок растворяется, желток остается внутри, заключенный в футляр из гиф. Из плесневых грибов чаще встречаются представители рода Penicillium, Aspergillus и др. Под влиянием аммонификаторов происходит гниение яиц. Образуется аммиак, сероводород и другие газы. Нередко такие газы разрывают скорлупу, содержимое выливается на соседние яйца, вследствие чего происходит их загрязнение и заражение микробами. Содержимое пораженных яиц зеленого, черного, желтого цвета. Из такой массы обычно выделяют микробов из группы Pseudomonas, Proteus, Bacillus, а также Escherichiа coli и др.  

Ход работы

• Овоскопия — просмотр яйца в проходимом свете. Для этой цели используют прибор овоскоп. С помощью овоскопа устанавливают наличие микробных поражений в яйце, при просвечивании видны колонии микробов (в виде темных пятен, точек), они могут быть разные по форме, размерам.
• Проба с погружением в воду. Яйцо осторожно погружают тупым концом в чашку с водой. При этом испорченное яйцо стоит на дне или всплывает, свежее — ложится на дно чашки.

Результаты работы заносятся в тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Каковы культурально — морфологические свойства молочнокислых бактерий, входящих в состав закваски для: обыкновенной простокваши; болгарской простокваши; кефира; кумыса и др.?
2. Какие кисломолочные продукты готовят с использованием в заквасках мезофильных, термофильных молочнокислых микроорганизмов?
3. По каким показателям можно судить о качестве молочнокислых продуктов?
4. В каких случаях производится исследование свежести мяса?
5. Какие показатели определяют при микробиологическом, органолептическом и биохимическом исследованиях?
6. Как и какие микроорганизмы могут проникать в яйца?
7. Какие методы используются для определения свежести яиц?