Лабораторная работа №5

  УЧЕТ ЧИСЛЕННОСТИ, ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМВ ПОЧВЫ, ВОДЫ, ВОЗДУХА   Цель занятия. Знать принципы учета, выделения чистой культуры и идентификации микроорганизмов различных субстратов. Уметь определять количество микробов в воде, почве и воздухе; выделять чистую культуру; идентифицировать микроорганизмы по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам. Материалы и оборудование., микробиологические петли, набор растворов красок для окраски по Граму, спирт, спиртовки, предметные стекла, фильтровальная бумага, микроскопы, лупы.  

1.  Санитарно-микробиологическое исследование почвы, воды, воздуха

  Почва – благоприятная среда для обитания и размножения различных микроорганизмов. В состав микробных биоценозов почвы входят бактерии, грибы, простейшие и бактериофаги. Микроорганизмы почвы участвуют в круговороте веществ в природе, минерализации органических отбросов, самоочищении почвы. Существенную роль в формировании микробного биоценоза почвы играют высшие растения, насекомые и животные. Содержание микроорганизмов в почве зависит от ее химического состава, влажности, температуры, рН и других показателей. Почва населена различными микроорганизмами. Среди них азотфиксирующие бактерии рода Azotobacter, клубеньковые бактерии рода Rhisobium, нитрифицирующие и денитрифицирующие бактерии, грибы, серо- и железобактерии, актиномицеты, гнилостные бактерии и др. В плодородной почве обнаружены энтеробактерии, псевдомонады, бациллы и клостридии. Эти микроорганизмы изменяют рН почвы в кислую сторону, и в ней начинают развиваться молочнокислые бактерии, дрожжи, грибы и др. микроорганизмы. Патогенные и условно-патогенные микроорганизмы не входят в состав микробных биоценозов почвы и через определенное время погибают, чему способствуют неблагоприятные условия обитания, отсутствие необходимых питательных веществ, а также антагонизм почвенных бактерий. Санитарная оценка почвы по микробиологическим показателям. При проведении текущего санитарного надзора за состоянием почвы осуществляют краткий санитарно-микробиологический анализ, который заключается в определении общей бактериальной обсемененности и титра кишечной палочки. Общая бактериальная обсемененность характеризует загрязнение почвы органическими веществами, а присутствие в ней бактерий группы кишечной палочки свидетельствует об уровне фекального загрязнения почвы. Титр кишечной палочки загрязненных участков почвы составляет от 0,001 до 0,00001 г, а чистых – 1 г и более.   При полном санитарно-микробиологическом анализе, кроме вышеуказанных показателей, в почве определяют количество анаэробов, палочку протея и термофильные микроорганизмы. Так, по соотношению вегетативных и споровых форм анаэробной палочки перфрингенс можно судить о времени фекального загрязнения, наличие палочки протея указывает на загрязнение почвы органическими веществами животного происхождения, а наличие термофилов – на загрязнение почвы навозом или компостами.   Воздух является неблагоприятной средой для развития микроорганизмов, что обусловлено недостатком питательных веществ и влаги, а также бактерицидным действием солнечных лучей. Поэтому количественный и видовой состав микрофлоры воздуха зависит от ряда факторов: климатических, метеорологических, сезонных, общего санитарного состояния местности и др. Наиболее часто в воздухе встречаются споры аэробных палочек рода Bacillus, пигментированные (окрашенные) штаммы бактерий (родов Sarcina, Staphylococcus и др.), а также грибы (родов Penicillium, Aspergillus и др.), дрожжи Rhodotorula. Патогенные микроорганизмы попадают в воздух из почвы и выделений человека и животных (при кашле, чихании). Выживаемость патогенных микроорганизмов в воздухе зависит от биологических свойств возбудителя, а также влажности и температуры. Санитарно-гигиеническое состояние воздуха оценивают по двум микробиологическим показателям: общей бактериальной обсемененности и содержанию гемолитических стрептококков и стафилококков (санитарно- показательные микроорганизмы воздуха). В 1 м³ воздуха производственных помещений не допускается содержания более 500 клеток микроорганизмов в зимнее время года и 1500 летом. По содержанию гемолитических стрептококков и стафилококков судят о присутствии в воздухе болезнетворных микробов. В 1 м³ воздуха не должно содержаться более 16 гемолитических стрептококков и стафилококков. Для снижения бактериальной обсемененности воздуха проводят проветривание и влажную уборку помещений, а иногда осуществляют фильтрацию поступающего воздуха через специальные воздушные фильтры. Для дезинфекции воздуха применяют физические и химические методы уничтожения микроорганизмов – обработку ультрафиолетовыми лучами (бактерицидные лампы), а также  обработку хлорсодержащими препаратами в виде их испарений и аэрозолей. Эффективным способом является озонирование воздуха. Вода является благоприятной средой для развития многих микроорганизмов. В состав микрофлоры воды входят сапрофиты: флуоресцирующие бактерии, микрококки, реже встречаются бактерии рода Bacillus. Содержание в воде микроорганизмов зависит от содержания в ней органических веществ. Степень обсеменения воды организмами характеризуется понятием сапробность воды – это совокупность живых существ, обитающих в водах,   загрязненных органическими веществами животного или растительного происхождения. Количество микроорганизмов в 1 см³ воды может варьироваться в широких пределах – от единиц до миллионов. Вода открытых водоемов более богата сапрофитными микроорганизмами, чем воды подземных источников. В речной воде встречаются гнилостные, нитрифицирующие, азотфиксирующие, серо- и железобактерии и др. Вода не является благоприятной средой для размножения болезнетворных микроорганизмов, однако многие из них сохраняются и выживают в ней определенное время.

Санитарная оценка воды по микробиологическим показателям

О безопасности воды в эпидемиологическом отношении судят по результатам                             ее          санитарно-бактериологического        исследования. Микробиологические показатели питьевой водопроводной воды нормированы ГОСТ 2874-82 «Вода питьевая. Гигиенические требования и контроль за качеством». Общая бактериальная обсемененность (микробное число) не более 100 клеток в 1 г, коли-титр – не менее 300 мл, коли-индекс – не более 3. Коли-титр – наименьший объем воды, в котором содержится одна кишечная палочка. Коли-индекс – количество кишечных палочек в 1 л воды. В СанПиНе 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества», введенного в действие с 1 января 2002 г, предъявляются более жесткие требования к питьевой воде. Для оценки санитарного состояния воды в ней определяют общее микробное число – не более 50 КОЕ/см³; термотолерантные колиформные бактерии – не допускаются в 100 см³; общие колиформные бактерии также должны отсутствовать в 100 см³; споры сульфитредуцирующих клостридий — не допускаются в 20 см³; колифаги – в 100 см³. Исследование питьевой воды проводят один раз в квартал при пользовании городским водопроводом и один раз в месяц при наличии собственных источников водоснабжения. Общее микробное число воды (ОМЧ) – количество мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при 37⁰С в течение 24 часов. К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37⁰С в течение 24 часов. Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, которые, кроме этого способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44 ⁰С в течение 24 часов. Сульфитредуцирующие клостридии (преимущественно Clostridium perfringens) – спорообразующие анаэробные палочковидные бактерии,   редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре в течение 24 часов при температуре 44⁰С. Колифаги – бактериальные вирусы, способные лизировать кишечную палочку и формировать зоны лизиса через 18±2 часа при температуре 37 ⁰С на ее газоне на питательном агаре. Колифаги – индикаторы очистки питьевой воды в отношении энтеровирусов. В отдельных случаях при санитарной оценке воды в качестве санитарно – показательного микроорганизма наряду с БГКП (бактерии группы кишечной палочки) используют энтерококки. Так, в Международном Европейском стандарте на питьевую воду наличие энтерококка определяют в качестве дополнительного показателя фекального загрязнения воды. Очистка и дезинфекция питьевой воды состоит из нескольких этапов:

1. Отстаивание в специальных отстойниках. При этом удаляются взвеси, нежелательные привкусы и запахи, происходит обесцвечивание, обессоливание и опреснение воды. Для ускорения отстаивания применяют коагулянты.
2. Фильтрование через слой речного песка. В верхних слоях фильтра формируется биологическая пленка, состоящая из содержащихся в воде примесей и хлопьев коагулянтов, на которых оседает большое количество микроорганизмов.

1. Обеззараживание профильтрованной воды, т.е. удаление оставшихся в воде микроорганизмов, среди которых могут быть и патогенные, с помощью различных дезинфицирующих средств (с помощью окислителей, путем озонирования, облучения ультрафиолетом, обработки ультразвуком).

Очистка сточных вод. Биологические методы очистки делятся на аэробные и анаэробные. В свою очередь, аэробная очистка может протекать в естественных и в искусственно создаваемых условиях. Очистка в естественных условиях проводится путем фильтрования сточных вод через слой почвы на полях орошения или полях фильтрации (почвенные методы очистки), а также в очистных прудах. При аэробной очистке в искусственных условиях процесс очищения ведут в специальных сооружениях: в биофильтрах и аэротенках. В аэротенках процесс очистки близок к естественным способам очистки, но интенсифицируется путем дополнительного насыщения кислородом. При этом активный ил (биоценоз микроорганизмов, с помощью которых осуществляется очистка) свободно плавает в воде в виде хлопьев. В биофильтрах биологическая очистка происходит при участии микроорганизмов, прикрепленных к биопленке. При аэробной очистке протекают интенсивные процессы по минерализации органических веществ различными гетеротрофными микроорганизмами, а также протекает активная нитрификация. Анаэробная очистка проводится в искусственно создаваемых сооружениях – метантенках, септиктенках и двухъярусных отстойниках. В   них осуществляется обработка твердой фазы сточных вод (осадков с решеток из первичных отстойников, а также активный ил и биопленка). При анаэробной очистке происходят различные микробиологические процессы (гниение, различные типы брожения). В результате, сложные органические соединения (белки, жиры, углеводы) сточных вод превращаются в жирные кислоты, спирты и газообразные вещества (диоксид углерода, аммиак, метан, водород). Остаток твердой фазы сточных вод, не разрушенный микроорганизмами обезвоживают, сушат и используют в виде удобрения, а спрессованный в виде брикетов – в качестве топлива.  

2.  Подсчет количества микроорганизмов в воде и почве

  Учет результатов. Клетки микроорганизмов, попав в питательную среду, начинают размножаться и образуют видимые невооруженным глазом колонии. При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете (если среда прозрачная, можно чашки помещать на темную подставку), и чтобы дважды не подсчитывать одни и те же колонии, отмечают их чернилами или тушью. Чтобы не пропускать мелкоточечные колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой. Можно использовать и специальный прибор для подсчета колоний (камера Вольфюгеля). Количество клеток микробов в 1 г почвы (1мл воды) устанавливают следующим образом. Х = А ´ В, где Х — число клеток микроорганизмов в 1 г почвы (1 мл воды); А — число колоний микроорганизмов на чашке Петри; В — соответствующее разведение.  

3.  Подсчет количества микроорганизмов в воздухе

  Учет результатов. По приблизительному расчету на площадь 100 см² за 5 минут осаждается примерно столько микробов, сколько их находится в 10 л воздуха (0,01 м³). Зная площадь чашки Петри, по этим данным можно подсчитать количество клеток в 1 м³ воздуха. Для этого число колоний, выросших в чашках Петри, относят к общей площади чашки, затем пересчитывают, сколько таких колоний поместилось бы на 100 см², и переводят на 1 м³ воздуха. П р и м е р. В чашке Петри диаметром 10 см выросло 45 колоний. Площадь чашки (pr²) = 3,14 ´ 5² =78,5 см². Чтобы подсчитать число клеток (Х) на 100 см² (равнозначных 10 л, или 0,01 м³ воздуха), составляют пропорцию 78,5 см² — 45 колоний 100 см² — Х колоний, откуда Х = 100 ´ 45 / 78,5, Х = 57,785.   Таким образом, в 0,01 м³ воздуха находится 57 клеток, а в 1 м³ их будет в 100 раз больше (5700). Чем больше пыли в воздухе, тем больше в нем микроорганизмов. По данным А. Ф. Войткевича, в Арктике при 70° с.ш. в 1 м³ воздуха содержится от 1 до 10 клеток. Морской воздух в таком же объеме содержит 1 — 2 клетки, воздух городского парка — 200, улицы в городе — 5 тыс., жилого помещения — 20 тыс., скотного двора — 1 — 2 млн.  

4.  Выделение чистой культуры микроорганизмов

  При изучении физиолого-биохимических особенностей и  цикла развития микробов, а также для установления их видовой принадлежности необходимо работать с чистой культурой микроорганизмов. Чистой называют такую культуру, которая получена из одной клетки и содержит микроорганизмы одного вида. То есть выделение из смеси одного вида микроба называют выделением чистой культуры. С этой целью специальными методами посевов достигается рост бактерий отдельными колониями. Пересев одной изолированной колонии в пробирку со стерильной питательной средой позволяет выделить чистую культуру. Для выделения чистой культуры существуют разные методы, одним из них является метод Дригальского — метод пластинчатого посева.  

Ход работы

Берут 4 — 5 стерильных чашек Петри. Агаровую среду в колбе расплавляют на водяной бане и разливают в чашки Петри равномерным слоем, застывая, образуется агаровая пластинка. Закрытые крышкой чашки Петри оставляют на столе. После уплотнения чашки помещают в термостат для подсушивания вверх дном на 3- 4 часа при 37 — 38°С. Каплю исследуемого материала микробиологической петлей наносят на поверхность агара и шпателем растирают равномерно на поверхности среды. Этим же шпателем, не обжигая его, растирают (засевают) по поверхности среды второй чашки, затем третьей, четвертой чашек; после посева их помещают в термостат вверх дном. Чашки выдерживают 2 — 7суток. Рост изолированных колоний обычно достигается в последних чашках. Далее нужную колонию отмечают, пересевают в МПБ и МПА, помещают в термостат для культивирования. Вырастает чистая культура.  

5.  Изучение культуральных свойств микроорганизмов

  Рост микроорганизмов на плотных средах (МПА) проявляется образованием колоний — скоплений микробов, образующихся в результате размножения одной микробной клетки.   Культуральные свойства определяют по характеру роста колоний на питательных средах. Изучение их проводят невооруженным взглядом и с помощью микроскопа (объектив ´8) или лупы.  

К культуральным признакам относятся:

1. Форма колонии  (овальная,   округлая,   звездчатая,   корневидная, ветвистая и др.) (рисунок 4).

    Рисунок 4 — Формы колоний А – круглая; Б – круглая с фестончатым краем; В – круглая с валиком по краю; Г, Д – ризоидные; Е – с ризоидным краем; Ж – амебовидная; З – нитевидная; И – складчатая; К – неправильная; Л – концентрическая; М — сложная  

2. Профиль колонии (выпуклый, плоский, конусовидный, кратерообразный, с валиком по окружности и др.) (рисунок 5).
3. Край колонии (ровный, волнистый, бахромчатый, зубчатый, локонообразный, лопастной и т. д.) (рисунок 6).
4. Размер колонии (крупные — диаметр свыше 4 мм, средние — диаметр 2 — 4 мм, мелкие — диаметр 1 – 2 мм, мельчайшие — росинчатые — диаметр меньше 1 мм).
5. Поверхность колонии (гладкая, бугристая, морщинистая, бороздчатая, с концентрическими кругами и др.).
6. Прозрачность колонии (прозрачная, непрозрачная, полупрозрачная).
7. Блеск колонии (блестящая, матовая, тусклая).
8. Цвет колонии (серая, белая, бесцветная, кремовая, оранжевая, красная, желтая и др.).
9. Консистенция колонии (определяется прикосновением к поверхности колонии микробиологической петлей) — плотная (легко снимается с агара или врастает в толщу среды), крошковатая, слизистая (тягучая, прилипает к петле), тестообразная, маслянистая и др.
10. Структура колонии (однородная, зернистая, волокнистая, пленчатая и др.) (рисунок 7).

      Рисунок 5 — Профиль колонии 1 – изогнутый; 2 – кратерообразный; 3 – бугристый; 4 – врастающий в субстрат; 5 – плоский; 6 – выпуклый; 7 – каплевидный; 8 – конусовидный           Рисунок 6 — Край колонии   1 – гладкий; 2 – волнистый; 3 – зубчатый; 4 – лопастной; 5 – неправильный; 6 – реснитчатый; 7 – нитчатый; 8 – ворсинчатый; 9 – ветвистый         Рисунок 7 — Структура колонии   1 – однородная; 2 – мелкозернистая; 3 – крупнозернистая; 4 – струйчатая; 5 — волнистая  

Ход работы

  Для работы используют культуры микроорганизмов на плотных питательных средах, посеянных на предыдущем занятии. На поверхности среды находят несколько (2 — 3) изолированных колоний и исследуют культуральные признаки. Результаты исследований заносят в тетрадь.  

6. Изучение морфологических свойств микроорганизмов

  К морфологическим признакам микроорганизмов относят: форму микробов (шаровидные, палочковидные, извитые); у палочковидных — форму концов клеток (закругленные, усеченные, вогнутые, заостренные и др.); характер расположения клеток (они могут быть одиночные, соединенные попарно, цепочки или в виде пакетов); размеры клеток в мкм; способность к спорообразованию; расположение спор; наличие капсул и клеточных включений; тинкториальную способность (окрашивание по методу Грама).  

Ход работы

Морфологические свойства изучают при микроскопировании окрашенных по Граму мазков, приготовленных из исследуемых колоний (те же, что использовали для описания культуральных признаков микробов). Микроскопируют под иммерсионным объективом (увеличение ´90). Результаты записывают в тетрадь. Примечание: Для определения видовой принадлежности микроорганизмов проводят изучение не только морфологических и культуральных свойств, но и физиолого-биохимических (ферментативных), а и в некоторых случаях антигенных и патогенных свойств.

Контрольные вопросы

1. Какие микроорганизмы входят в состав микрофлоры почвы?
2. По каким микробиологическим показателям проводят санитарную оценку почвы?
3. В каких случаях проводят полный микробиологический анализ почвы?
4. Охарактеризуйте состав микрофлоры воздуха.

 

5. Как проводят санитарную оценку воздуха? Какие методы используют для очистки и обеззараживания воздуха?
6. Какие микроорганизмы входят в состав микрофлоры воды?
7. Что такое «сапробность воды»?
8. Каким образом проводят аэробную очистку сточных вод в искусственных условиях? Какие микробиологические требования предъявляются к питьевой воде?
9. Какие способы очистки сточных вод Вам известны?
10. Каким образом проводят очистку и дезинфекцию питьевой воды? 11.Что такое культура, смешанная культура, чистая культура, штамм и

колония микробов?

12. Какие методы применяют     для    получения     чистых     культур микроорганизмов?
13. Какими методами определяют общее число микробов в воде, почве и воздухе?
14. Какие культуральные и морфологические признаки учитывают при идентификации микроорганизмов?