Лабораторная работа по дисциплине «Микробиология» для ВГУ

Лабораторное занятие 15. Методы обнаружения и идентификации патогенных микроорганизмов

Методы обнаружения и идентификации патогенных микроорганизмов

Методы бактериологического исследования активно применяются для детального обследования больных, установления этиологического фактора инфекционного процесса, назначения рациональной терапии и определения ее эффективности. Разнообразие клинического материала и своеобразие микрофлоры отдельных органов определяют особенности методов бактериологического исследования, которые требуют применения специальных приемов отбора проб, посевов на питательные среды и проведения анализов. В бактериологическое исследование клинического материала входит несколько этапов: отбор проб на исследование, посев на питательные среды, выделение чистой культуры, идентификация и дифференциация выделенных культур микроорганизмов, анализ результатов исследования (табл. 3). Необходимо помнить, что образцы для исследований следует отбирать как можно раньше либо с учетом ритма циркуляции возбудителя; материал следует отбирать в объеме, достаточном для всего комплекса исследований; образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно, при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 °С. Таблица 3. Схема выделения и идентификации чистых культур аэробных и анаэробных бактерий

Исследуемый материал

↓

I этап (нативный материал) Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре) Подготовка материала к исследованию Посев на среды обогащения Посев на плотные питательные среды (получение колоний)

↓

II этап (изолированные колонии) Микроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (величина, форма, цвет, прозрачность, положение, поверхность, консистенция, структура края). Микроскопическое изучение колоний под малым увеличением микроскопа и в окрашенном мазке. Постановка пробы на аэротолерантность. Посев на скошенный питательный агар (выделение чисто культуры).

↓

III этап (чистая культура) Идентификация выделенной культуры по комплексу биологических свойств: морфология и тинкториальные свойства. культуральные свойства. биохимические свойства. серологические свойства. фаголизабельность. чувствительность к антибиотикам. другие свойства.

Микробиологическая диагностика необходима прежде всего для определения причины инфекционных заболеваний. Методы лабораторной диагностики микроорганизмов можно разделить на пять основных категорий: микроскопические, бактериологические (выделение чистой культуры микроорганизмов и ее идентификация), биологические (заражение лабораторных животных с воспроизведением инфекционного процесса на чувствительных моделях (биопроба)), иммунологические (серологические, аллергические), молекулярно-генетические.

1. Изучение морфологии микроорганизмов

Морфологию микроорганизмов изучают путём микроскопии мазков из патологического материала и из культур, окрашенных по Граму, и др. методами. Окрашенные клетки микроорганизмов резко отличаются от общего фона препарата, что позволяет установить морфологические особенности микроорганизмов (форму, размеры, наличие спор, жгутиков, капсул) и степень чистоты выделяемой культуры. Существуют простые и сложные методы окраски. При простых методах можно использовать только одну краску. Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выявить определенные структуры бактериальной клетки. Унифицированным методом окраски является метод по Граму. Данный метод позволяет дифференцировать бактерий по различиям в строении клеточной стенки. Однако, при выявлении многих патогенных микроорганизмов она не является дифференциально-диагностической. В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их формы, подвижности или определения прижизненной внутренней структуры. Изучают нативные и окрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли. При изучении подвижности микроорганизмов необходимо отличать истинную подвижность от броуновского движения, которое является следствием ударов о бактерии движущихся в растворе молекул и выявляется в виде колебаний. Многие подвижные микроорганизмы движутся очень быстро, что затрудняет наблюдение. Добавляя к суспензии микроорганизмов метилцеллюлозу, можно уменьшить скорость их движения и создать условия, при которых движение жгутиков становится видимым.

2. Изучение культуральных свойств микроорганизмов

В природе микроорганизмы существуют в смешанной популяции. Для изучения свойств микроорганизмов, определения их систематического положения необходимо прежде всего изолировать отдельные виды микробов и вырастить их в виде так называемых «чистых культур», а затем идентифицировать, т. е. установить их соответствие видам, описанным в специальных определителях. Посев инокулята является первым этапом исследования. В практической работе для получения «чистых культур» микроорганизмов используют одну из модификаций метода высева на чашки со средой. Эти методы основаны на том, что отдельные микроорганизмы развиваются на поверхности либо в глубине питательной среды, в которую добавлен агар или какое-нибудь другое гелеобразующее вещество. Первичный высев материала на чашку Петри осуществляется одним из нижеперечисленных способов.

1. Посев петлей: посевной материал втирают петлей в поверхность среды у края чашки, избыток снимают, проколов петлей агар, а оставшийся материал рассеивают параллельными штрихами по стерильной поверхности среды (рис. 17).
2. Посев шпателем: материал наносят на поверхность среды петлей или пипеткой, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его по всей поверхности агара. После посева металлический шпатель прокаливают в пламени горелки, а стеклянный помещают в дезинфицирующий раствор.
3. Посев тампоном: тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.
4. Посев на секторы: дно чашки расчерчивают на секторы, посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру так, чтобы штрихи с одного сектора не переходили на другой (рис. 18).
5. Посев газоном: 1 мл исследуемого материала (жидкой бульонной культуры или взвеси микробов в физиологическом растворе) наносят пипеткой и тщательно распределяют по всей поверхности среды. Избыток материала отсасывают пипеткой и вместе с ней помещают в дезинфицирующий раствор.

При выделении чистых культур аэробов можно использовать методы, основанные не только на механическом разобщении бактерий, но и на их различиях по биологическим свойствам. Так, например, некоторые подвижные бактерии могут быстро распространяться по слегка влажной поверхности питательной среды, благодаря этому можно очистить их от неподвижных видов микробов. Иногда при выделении микроорганизмов из природных популяций полезно включить в среду вещества, избирательно подавляющие рост тех или иных микробов. Например, добавляя полиеновые антибиотики (нистатин) в среду, очищают бактериальные культуры, сильно загрязненные грибами. Посевы инкубируются в термостате 18 – 24 ч. В течение этого времени из отдельных микробных клеток формируются изолированные колонии. Второй этап исследования – изучение изолированных колоний. Колония – это изолированное скопление микробных клеток одного вида на плотной питательной среде. Строение колоний является важным культуральным признаком при определении вида микроорганизмов, так как каждому виду микробов при росте на определенной плотной питательной среде присуща типичная форма колонии. Колонии изучают невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете и с помощью лупы или под микроскопом при малом увеличении. В проходящем свете их рассматривают со стороны дна чашки; отмечают величину колоний (крупные – от 4 – 5 мм в диаметре и более; средние – 2 – 4 мм; мелкие – 1 – 2 мм и карликовые – меньше 1 мм), их форму (правильная, круглая, неправильная, плоская, сферическая) и прозрачность (рис. 19). Рис. 19. Формы колоний микроорганизмов (по: Шильникова В. К., 2004): а – круглые; б – круглые с фестончатым краем; в – круглые с валиком по краю; г и д – ризоидные; е – с ризоидным краем; ж – амебовидные; з – нитевидные; и – складчатые; к – неправильные; л – концентрические; м – сложные (Сбойчаков) В отраженном свете, рассматривая колонии со стороны крышки, определяют цвет (бесцветная, окрашенная), характер поверхности (гладкая, бугристая, блестящая, матовая), расположение колоний на поверхности среды (выпуклое, плоское, вдавленное). Обращают внимание на характер краев колоний (ровные, фестончатые, зазубренные), структуру (гомогенная, зернистая, однородная или различная в центре и по периферии). Различают два основных типа колоний бактериальной культуры: а) гладкие – S-тип (от англ. smooth – гладкий), характеризующийся круглой и выпуклой формой, гладкой поверхностью, влажной консистенцией; б) шероховатые – R-тип (от англ. rough – шероховатый), характеризующийся шероховатой поверхностью, неправильными краями, сухой консистенцией. Образуются из гладких S-форм в результате мутации. Помимо этих двух основных типов колоний существует так называемый слизистый М-тип (от лат. mucus – слизистый), характеризующийся тягучей слизистой консистенцией; образуется в процессе диссоциации бактериальных культур. Часть изученной колонии берут для приготовления мазка, который окрашивают и микроскопируют. При подтверждении однородности состава колонии микроскопированием оставшуюся ее часть отвивают на скошенный агар для накопления чистой культуры. Для идентификации культур, т. е. установления вида и типа бактерий, помимо морфологических и культуральных изучают биохимические, антигенные и другие свойства. При выделении чистых культур облигатных анаэробов в основном пользуются методами глубинного посева в агар для исключения попадания кислорода в культуральную среду.

3. Изучение биохимических свойств бактерий

Изучение биохимических свойств выделенных микроорганизмов проводят на третьем этапе. Культуру микроорганизмов, выросшую на скошенном агаре, проверяют на чистоту путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. При этом обращают внимание на форму микроба, величину, расположение клетки. Используя специальное окрашивание выявляют споры, капсулы, включения и жгутики (см. тема 6, тема 7).. Совокупность полученной информации о свойствах бактерий сопоставляют с характеристикой определенных таксонов и дают заключение о таксономическом положении бактерий.

4. Иммунологические методы (серологические, аллергологические)

Серологические методы выявления специфических антител (АТ) и антигенов (АГ) возбудителя — важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудитель невозможно. При этом необходимо выявить повышение титров АТ, в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале от 10 до 20 сут (иногда этот интервал может быть более длительным). АТ обычно появляются в крови на 1—2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для ретроспективных эпидемиологических исследований. Определение классов Ig четко характеризует этапы инфекционного процесса, а также может служить косвенным прогностическим критерием. Особое значение имеют методы выявления микробных АГ. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а их количественное определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии. АГ многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, что используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований. Наибольшее распространение нашли кожно-аллергические пробы, включающие внутрикожное введение АГ (аллергена) с развитием реакции гиперчувствительности замедленного типа. Кожные пробы нашли применение в диагностике таких заболеваний как сап, мелиодиоз, бруцеллез. Наиболее известна проба Манту, используемая как для диагностики туберкулеза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю. В последние годы все шире применяются методы геноиндикации микроорганизмов, которые не требуют выделения чистых культур: метод ДНК-зондов, полимеразная цепная реакция (ПЦР) со специфическими праймерами.

5. Молекулярно-генетические методы идентификации микроорганизмов

Метод ДНК-ДНК-гибридизации является более важным для оценки генетического родства бактерий. Внутри одного вида бактерий степень генетической гомологии штаммов достигает 70-100%. Однако если в результате эволюционной дивергенции последовательностей нуклеотидных оснований геномов двух бактерий различаются в большей степени, то специфическая реассоциация ДНК-ДНК становится такой слабой, что не поддается измерению. В таком случае гибридизация ДНК-рРНК позволяет значительно увеличить круг организмов, у которых можно определить степень генетической гомологии благодаря тому, что на относительно небольшом участке бактериального генома, кодирующем рибосомные РНК, исходная последовательность оснований сохраняется значительно полнее, чем на других участках хромосомы. В итоге методом ДНК-рРНК-гибридизации часто обнаруживают довольно высокую гомологию геномов бактерий, у которых реассоциация ДНК-ДНК не выявляет заметной гомологии. Для идентификации бактерий иногда используют также метод ДНК-зондов – разновидность метода молекулярной гибридизации ДНК-ДНК. Реакция гибридизации ведется в этом случае не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментом нуклеотидной последовательности ДНК (зондом), включающим генетический маркер (ген), ответственный за какую-то определенную функцию (например, устойчивость к антибиотику), и ДНК изучаемой бактерии. Самым распространенным способом создания генных зондов является выделение специфических фрагментов путем молекулярного клонирования. Для этого вначале создают банк генов изучаемой бактерии, затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов ДНК. Далее выбранный фрагмент ДНК сшивают с подходящей плазмидой, и полученную рекомбинантную плазмиду вводят в удобный штамм бактерий (например, в E.coli). Из биомассы бактерии, несущей ДНК зонд, выделяют плазмидную ДНК и метят ее радиоизотопной меткой. Затем осуществляют гибридизацию генетического зонда с ДНК бактерии. Образовавшиеся гибридные участки проявляют методом авторадиографии. По относительной частоте гибридизации генетического маркера с хромосомой той или иной бактерии делают заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуемым штаммом. Для идентификации бактерий и создания филогенетической системы их классификации наиболее широкое распространение и значение получил метод анализа нуклеотидных последовательностей в рибосомальных РНК. Молекулы 5S, 16S и 23S рРНК содержат участки с самой высокой степенью генетической стабильности. Считается, что они находятся вне механизма естественного отбора и эволюционируют только в результате спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью. В случае анализа 5S рРНК обычно определяют полную последовательность нуклеотидов, которая в этой молекуле у прокариот составляет 120 нуклеотидов. При исследовании 16S и 23S рРНК, содержащих 1500 и 2500 нуклеотидов соответственно, часто проводят анализ олигонуклеотидов, полученных из этих молекул при помощи специфических рестриктаз. В настоящее время также разработаны иммунофлуоресцентные методы (ИФМ), позволяющие выявить интересующий исследователя организм без выделения в чистую культуру. В основе любых модификаций ИФМ используется взаимодействие антиген-антитело, которое соединено с флуоресцирующим красителем. Специфичность реакции антиген-антитело высока, поэтому и вероятность выявления микроорганизма в природных образцах или накопительных культурах тоже высока. Недостатком являются относительно долгая процедура приготовления сывороток с красителями и существование перекрестных реакций. Недостатков ИФМ лишен метод, основанный на взаимодействии флоуресцентно окрашенных олигонуклеотидов с соответствующими участками 16S рРНК целых клеток (метод FISH — Fluorescent in situ hybridization). При флюоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды, которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флюоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стептавидина, а дигоксигенин — при помощи флюоресцентно-меченых антител. Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя.

Тема 12. Антибиотикочувствительность

Цели занятия:

1. Ознакомиться с понятием «антибиотики», видами антибиотиков и методами определения антибиотикочувствительности;
2. Определить спектр действия антибиотика методом дорожки по Флемингу;
3. Определить антибиотикочувствительность методом дисков.

Материалы и оборудование: спиртовки, спирт, чашки Петри со стерильным МПА, скальпели, пробирки со стерильным МПА, микробиологическая петля, культуры кокков и палочек, фильтровальная бумага, ножницы, растворы антибиотиков (бензилпенициллин, стрептомицин, рифампицин, диокситоцин, по 10 мкг/л), пинцет. Антибиотики (от греч. anti — против, bios — жизнь) — продукты жизнедеятельности живых организмов, способные избирательно убивать микроорганизмы или подавлять их рост. Антибиотики могут оказывать на микроорганизмы бактериостатическое и бактерицидное действие. Бактерицидное действие антибиотиков вызывает гибель микроорганизмов, а бактериостатическое — подавляет или задерживает их размножение. Характер действия зависит как от антибиотика, так и от его концентрации. Механизм антимикробного действия антибиотиков разнообразен: одни нарушают синтез клеточной стенки бактерий (пенициллин, цефалоспорины), другие тормозят процессы синтеза белка в клетке (стрептомицин, тетрациклин, левомицетин), третьи угнетают синтез нуклеиновых кислот в бактериальных клетках (рифампицин и др.). Для каждого антибиотика характерен спектр действия, т. е. препарат может оказывать губительное действие на определенные виды микроорганизмов. Антибиотики широкого спектра активны в отношении различных групп микроорганизмов (тетрациклины) или угнетают размножение многих грамположительных и грамотрицательных бактерий (стрептомицин и др.). Ряд антибиотиков действует в отношении более узкого круга микроорганизмов, например, к полимиксину чувствительны преимущественно грамотрицательные бактерии. По спектру действия антибиотики разделяют на антибактериальные, противогрибковые и противоопухолевые. Антибактериальные антибиотики угнетают развитие бактерий и составляют наиболее обширную группу препаратов, различных по химическому составу. Для лечения инфекционных болезней, вызываемых бактериями, чаще используют антибиотики широкого спектра действия: тетрациклины, левомицетин, стрептомицин, гентамицин, канамицин, полусинтетические пенициллины и цефалоспорины и другие препараты. Противогрибковые антибиотики (нистатин, леворин, амфотерицин В, гризеофульвин) оказывают угнетающее действие на рост микроскопических грибов, так как нарушают целостность цитоплазматической мембраны микробных клеток. Применяются для лечения грибковых заболеваний. Противоопухолевые антибиотики (рубомицин, брунеомицин, оливомицин) угнетают синтез нуклеиновых кислот в животных клетках и используются для лечения различных форм злокачественных новообразований. Биологическую активность антибиотиков измеряют в международных единицах действия (ЕД). За единицу активности антибиотика принимают наименьшее количество препарата, которое оказывает антимикробное действие на чувствительные к нему тест-бактерии (например, для пенициллина — золотистый стафилококк, стрептомицина — кишечная палочка и т. п.). В настоящее время единицы активности антибиотиков выражают в микрограммах чистого препарата. Так, за единицу активности пенициллина принимают 0,6 мкг, а для большей части антибиотиков 1 ЕД соответствует 1 мкг (стрептомицин и др.). Некоторые антибиотики (пенициллин, стрептомицин и др.), введенные в организм больного, вызывают аллергию, нарастающую по мере применения препарата. Аллергические реакции развиваются в виде сыпи-крапивницы, отеков век, губ, носа, дерматитов. Наиболее грозным осложнением является анафилактический шок, от которого может наступить смерть больного. Введение в организм больших доз антибиотиков широкого спектра действия, как правило, сопровождается и гибелью представителей нормальной микрофлоры дыхательных путей, кишечника и других органов. Это приводит к изменению обычных антагонистических отношений между микроорганизмами в естественных условиях. В результате этого условно-патогенные бактерии (стафилококки, протей) и грибы рода Candida, устойчивые к этим антибиотиком, могут активизироваться и вызывать вторичные инфекции. Так возникают грибковые поражения — кандидозы кожи, слизистых оболочек, внутренних органов; дисбактериозы (нарушения нормального состава микрофлоры). Для предотвращения развития кандидамикозов антибиотики вводят с противогрибковыми препаратами, например нистатином и др. Применение препаратов, приготовленных из представителей нормальной микрофлоры (колибактерин, бифидумбактерин, бификол) после приема антибиотиков, предупреждает развитие дисбактериоза. Длительное лечение и применение антибиотиков может оказывать токсическое действие на организм больного: тетрациклины могут вызвать поражение печени, левомицетин — органов кроветворения, стрептомицин в ряде случаев поражает вестибулярный и слуховой анализаторы, цефалоспорины способны нарушать функции почек. Многие антибиотики часто вызывают гиповитаминоз и раздражение слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта. Антибиотики могут оказывать вредное действие на развитие плода, особенно у женщин, употреблявших антибиотики в первый период беременности. Прямое влияние на организм плода оказывают антибиотики группы тетрациклина. Часто при лечении антибиотиками происходит превращение чувствительных к антибиотику микроорганизмов в устойчивые (резистентные) формы. Приобретенная устойчивость бактерий к антибиотику передается по наследству новым популяциям бактериальных клеток. Методы определения антибиотикочувствительности. Метод дорожки по Флемингу. Метод применяют для определения спектра действия антибиотика. В чашке Петри с МПА стерильным скальпелем вырезают дорожку шириной 1 см и удаляют ее. Затем в пробирку с растопленным и охлажденным до 42-45° С мясопептонным агаром вносят определенную концентрацию раствора антибиотика. Содержимое пробирки перемешивают и выливают в дорожку так, чтобы жидкость не выходила за ее пределы. После застывания агара перпендикулярно к дорожке засевают петлей культуры нескольких исследуемых микроорганизмов. Посевы помещают в термостат на 18-24 ч. Учет результатов. Чувствительные к препарату культуры начинают расти лишь на некотором расстоянии от дорожки, нечувствительные растут до самого края. Метод дисков Исследуемую культуру засевают газоном на чашку Петри с МПА. Для этого 1 мл жидкой культуры наносят на поверхность агара и тщательно распределяют жидкость по поверхности среды. Чашку слегка наклоняют и пипеткой отсасывают избыток культуры. Засеянные чашки подсушивают 30-40 мин при комнатной температуре. Затем на поверхность засеянного агара пинцетом накладывают бумажные диски, пропитанные растворами антибиотиков. Каждый диск слегка прижимают браншами пинцета, чтобы он плотно прилегал к поверхности агара. Диски накладывают на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки. Одну чашку можно использовать для изучения чувствительности одного штамма к 4-5 антибиотикам. Засеянные чашки с нанесенными на них дисками помещают в термостат при 37° С на 18-24 ч. Чашки ставят вверх дном, чтобы избежать попадания конденсационной воды на поверхность посевов. Учет результатов. Действие антибиотиков оценивают по феномену задержки роста вокруг диска (рис. 20). Диаметр зон задержки роста микробов вокруг дисков определяют с помощью линейки, включая диаметр самого диска. Между степенью чувствительности микроба к антибиотикам и величиной зоны отсутствия роста имеются следующие соотношения (табл. 4). Таблица 4. Определение степени чувствительности микроорганизмов к антибиотикам по величине зоны отсутствия роста

Степень устойчивости микроба к антибиотику	Диаметр зоны отсутствия роста, мм
Чувствительные	>10
Малоустойчивые	<10
Устойчивые	Полное отсутствие

Приготовление дисков Вырезают из фильтровальной бумаги кружочки диаметром 5 мм. При помощи пинцета обмакивают их в растворы антибиотиков (бензилпенициллин, стрептомицин, рифампицин, диокситоцин, по 10 мкг/л). Подсушивают диски на воздухе. Задание.

1. Приготовить диски с антибиотиками.
2. Засеять исследуемую культуру газоном на чашку Петри.
3. Определить спектр действия пенициллина методом дорожки по Флемингу.
4. Определить антибиотикочувствительность методом дисков.