Лабораторная работа по дисциплине «Микробиология» для ВГУ

Лабораторное занятие 14. Анаэробное дыхание: нитрат- и сульфатредуцирующие бактерии

Анаэробное дыхание: нитрат- и сульфатредуцирующие бактерии

Цели занятия:

1. Ознакомиться с особенностями функционирования ЭТЦ прокариот при анаэробном дыхании;
2. Провести качественную реакцию на присутствие в почве денитрифицирующих бактерий;
3. Провести качественную реакцию на присутствие в пробах воды сульфатредуцирующих бактерий.

Материалы и оборудование: микроскопы, предметные стекла, покровные стекла, культура нитратредукторов, реактив Грисса, чашка Петри, шпатель, культура сульфатредукторов. Дыхание – это процесс образования энергии, сопряженный с функционированием электронтранспортной цепи. Сложные органические соединения расщепляются на мономеры (аминокислоты, жирные кислоты, моносахариды), которые через несколько реакций превращаются в глюкозу. Глюкоза окисляется до пирувата через гликолиз (рис. 12). При этом затрачивается две молекулы АТФ на активацию субстрата, а затем выделяется четыре молекулы АТФ. Таким образом, энергетический выход гликолиза составляет две молекулы АТФ на одну молекулу глюкозы. Образующийся в ходе гликолиза пируват окисляется до ацетил-КоА в результате работы пируватдекарбоксилазного комплекса. При этом образуется одна молекула АТФ из каждой молекулы пирувата. Ацетил-КоА полностью окисляется в цикле Креббса до углекислого газа и воды (рис. 12). При этом из одной молекулы ацетил-КоА образуется одна молекула АТФ, одна молекула FADH₂ и три молекулы NADH. FADH₂ и NADH сбрасывают электроны в электронтранспортную цепь. В зависимости от конечного акцептора электронов при окислении одной молекулы NADH образуется одна, две или три молекулы АТФ, а из одной молекулы FADH₂ образуется одна или две молекулы АТФ. Различают аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов является кислород, а при анаэробном – какое-либо другое окисленное органическое или неорганическое соединение (фумарат, железо (III), сульфат, нитрат). При аэробном дыхании электронтранспортная цепь функционирует полностью, и в ней имеется три пункта фосфорилирования (рис. 13). Соответственно, из каждой молекулы NADH образуется 3 АТФ, а из каждой молекулы FADH₂ – 2 АТФ. Рассчитаем количество АТФ, образующихся из одной молекулы глюкозы при аэробном дыхании (донор электронов – глюкоза, акцептор – кислород). В ходе гликолиза затрачивается 2 АТФ и образуется 4 АТФ и 2 NADH. Далее дважды работает пируватдекарбоксилазный комплекс и образует 2 молекулы NADH. Затем дважды работает цикл Кребса. При этом образуются 2 молекулы АТФ, 6 молекул NADH и 2 молекулы FADH₂. Всего образуется 4 молекулы АТФ, 10 молекул NADH и 2 молекулы FADH₂. В результате функционирования ЭТЦ образуется 10*3=30 молекул АТФ из молекул NADH и 2*2=4 молекулы АТФ из молекул FADH₂. Таким образом, энергетический выход аэробного дыхания на глюкозе составляет 4+30+4=38 молекул АТФ. В случае анаэробного дыхания дыхательная цепь укорочена с конца: терминальный акцептор принимает электроны на уровне цитохрома b или цитохрома с, соответственно в дыхательной цепи будет два или один пункт фосфорилирования (рис. 14). Следовательно, анаэробное дыхание менее энергодающий процесс, чем аэробное. Пример. Рассчитать количество образующихся АТФ в случае, если донором электронов выступает фруктозо-6-фосфат, а акцептором электронов – нитрат. В этом случае затрачивается на одну молекулу АТФ меньше в ходе гликолиза. Нитраты принимают электроны с цитохрома b. Следовательно, из одной молекулы NADH образуется одна молекула АТФ, а из FADH₂ АТФ не образуется. Таким образом, общее количество АТФ: 5+10*1+2*0=15 АТФ. Задание.

1. Рассчитать количество образующихся АТФ а случае, если донором электронов выступает пируват, а акцептором электронов – сульфат.
2. Рассчитать количество образующихся АТФ а случае, если донором электронов выступает глюкоза, а акцептором электронов – фумарат.
3. Рассчитать количество образующихся АТФ а случае, если донором электронов выступает цитрат, а акцептором электронов – Fe(III).
4. Рассчитать количество образующихся АТФ а случае, если донором электронов выступает глицеральдегид-3-фосфат, а акцептором электронов – нитрит.

Нитратредуцирующие (=денитрифицирующие) бактерии Денитрифицирующие бактерии — бактерии, восстанавливающие нитраты до молекулярного азота. К ним относятся представители более 150 видов из 50 родов (в том числе Pseudomonas, Achromobacter, Bacillus и Micrococcus). Это физиологическая, а не таксономическая группа. Они обитают в почве, воде и донных отложениях. Полную денитрификацию до образования газообразных продуктов проводят только прокариоты. Все денитрифицирующие бактерии — факультативные анаэробы. Попадая в анаэробные условия, они переключаются с кислородного дыхания на менее энергодающее нитратное дыхание. В этом случае терминальным акцептором электронов служит нитрат, который принимает электроны на уровне цитохрома b. Нитрат последовательно восстанавливается до нитрита, окиси азота, закиси азота и газообразного азота (рис. 15). Реакция восстановления нитрата в нитрит катализируется периплазматической нитратредуктазой Nap или мембрансвязанной нитратредуктазой Nar. Дальнейшее восстановление нитрита катализируется NO-образующей нитритредуктазой, редуктазой NO (Nor) и редуктазой N₂O (Nos). Денитрификация имеет как положительное, так и отрицательное значение. Ее минусом является образование парникового газа N₂O, который способствует разрушению озонового слоя и удаление из почву доступной формы азота. Плюс же заключается в удалении из почвы избытков нитрата, который в больших концентрациях является канцерогеном и может вызывать евтрофикацию водоемов. Выявление денитрифицирующих бактерий Присутствие в почве денитрифицирующих бактерий определяют по образованию разрывов в агаре из-за образования газообразных продуктов на твердой среде Березовой. Среда Березовой Состав (в граммах на 1 л дистиллированной воды): цитрат калия или натрия — 2,0; KNO₃— 1,0; KH₂PO₄— 1,0; K₂HPO₄ — 1,0; MgSO₄·7H₂O — 2,0 г; CaCI₂·6H₂O — 0,2 г; FeCI₃·6H₂O — следы (1 мл 1%-ного раствора на 1 л среды). Среду стерилизуют при давлении 101,3 кПа в течение 20 мин. Срок хранения среды — не более 6 мес; в холодильнике — не более 10 дней. В стерильные пробирки вносят по 1 г почвы, заливают расплавленной и охлажденной до 40-50 ⁰С средой, закрывают резиновыми пробками и помещают в термостат на 37 ⁰С. Одну пробирку для контроля заливают средой, но не вносят в нее почву. По истечении 7 суток в контрольной пробирке внешний вид среды не изменяется, в опытных пробирках появляются разрывы в агаре за счет образования газообразных продуктов в процессе денитрификации. Качественная реакция на нитриты Об образовании в процессе денитрификации нитрита из нитрата судят по качественной реакции на нитриты с реактивом Грисса. На планшет или в чашку Петри капают каплю реактива Грисса и каплю исследуемой среды. В случае присутствия в среде нитритов цвет реактива изменяется на розовый. Сульфатредуцирующие (=десульфатирующие, =сульфидогенные) бактерии Сульфатредукторы — прокариоты, способные к анаэробному дыханию с использованием в качестве конечного акцептора электронов сульфата. Они широко распространены в илах, а также в симбиотических анаэробных нишах. Это физиологическая, а не таксономическая группа. К ней относятся бактерии (Desulfobacter, Desulfovibrio, Desulfobulbus, Desulfonema, Desulfosarcina, Desulfomonas, Thermodesulfobacterium) и археи (Archeoglobus, Thermocladium, Caldivigra). Сультатредукторы восстанавливают сульфат до сульфита, который в дальнейшем может окисляться до сульфида. Образование сульфита идет через промежуточный продукт аденозинфосфосульфат (АФС) (рис. 16). Этот процесс катализируется АТФ-сульфурилазой и АФС-редуктазой. Сульфат принимает электроны на уровне цитохрома с. Поэтому сульфатное дыхание еще менее энергодающее, чем нитратное. Обнаружение сульфатредуцирующих бактерий Сульфатредуцирующие бактерии, как Desulfovibrio, превращают сульфат в сульфид, который, реагируя с ионами железа, образует черный осадок. Для культивирования создают анаэробные условия, заполняя средой максимально пробирку с завинчивающейся крышкой Состав среды для обнаружения сульфатредуцирующих бактерий в воде, грамм/литр: Часть А:

• Пептический перевар животной ткани 2,00;
• Мясной экстракт 1,00;
• Магния сульфат 2,00;
• Натрия сульфат 1,50;
• Калия гидрофосфат 0,50;
• Кальция хлорид 0,10.
• Гомогенный сыпучий порошок желтого цвета.

Часть В:

• Железа аммонийного сульфат 0,392;
• Натрия аскорбат 0,10;
• Гомогенный сыпучий порошок кремово-белого цвета.

Часть С:

• Натрия лактат 3,50.
• Бесцветный раствор.
• Конечное значение рН (при 25ºС) 7,5 ± 0,2.
• Готовая среда светло-желтого цвета, прозрачная, слегка опалесцирует.

Размешать 7,1 г порошка части А в 900 мл дистиллированной воды. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121ºС) в течение 15 мин. В день использования среды приготовить раствор части В в 100 мл дистиллированной воды. Стерилизовать фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Асептично добавить 100 мл части В в 900 мл части А. Затем добавить к полученной смеси часть С, стерилизованную отдельно автоклавированием при 1,1 атм (121ºС) в течение 15 мин. Тщательно перемешать и асептично разлить полную среду по стерильным пробиркам с завинчивающимися крышками, максимально заполняя их. Задание. 1) Оценить рост нитратредукторов на твердой среде Березовой 2) Провести качественную реакцию на образование нитритов 3) Оценить рост сульфатредукторов из проб воды.