Лабораторная работа по дисциплине «Микробиология» для ВГУ

Лабораторное занятие 11. Азотфиксация. Аммонификация

Азотфиксация. Аммонификация

Цели занятия:

1. Ознакомиться с процессами азотфиксации и аммонификации, а также с представителями азотфиксирующих и аммонифицирующих бактерий;
2. Приготовить препарат Rhizobium;
3. Приготовить препарат Azotobacter;
4. Провести выявление аммонифицирующий активности бактерий.

Материалы и оборудование: микроскопы, предметные стекла, покровные стекла, пинцет, микробиологические петли, клубеньки сои, метиленовый синий, культура Azotobacter, тушь, карболовый раствор фуксина, культура уробактерий, реактив Несслера, чашка Петри, пипетка, лакмусовая бумажка. Для конструктивного метаболизма живые организмы нуждаются не только в источниках углерода, но и в источниках азота. Прокариоты могут использовать в качестве источников азота молекулярный азот, а также органические и неорганические азотсодержащие соединения. Использование бактериями молекулярного азота носит название азотфиксация, а азота органических соединений – аммонификация. Азотфиксация К азотфиксации или диазотрофии способны только прокариоты. Это важный этап круговорота азота, возвращающий в почву молекулярный азот из атмосферы. Молекула азота состоит из двух атомов, соединенных тройной связью. Разрыв связи идет в три этапа с затратой большого количества энергии (940 кДж/моль). Реакция азотфиксации катализируется нитрогеназным комплексом, включающем в себе более 20 субъединиц. Каталитическая субъединица кодируется геном nifH. Присутствие этого гена в организме является маркером азотфиксации. К азотфиксаторам относятся свободноживущие и симбиотические микроорганизмы. Классическим примером симбиотических азотфиксаторов являются клубеньковые бактерии рода Rhizobium, образующие симбиоз с корнями бобовых растений. Клубеньковые бактерии обладают избирательной способностью вступать в симбиотические взаимоотношения с различными бобовыми растениями. На основании специфичности симбиоза все клубеньковые бактерии делят на виды: бактерии гороха – Rhizobium leguminosarum, донника и люцерны — Rh. meliloti; клевера — Rh.trifolii; фасоли — Rh.phaseoli; люпина — Rh. lupini; сои — Rh. japonicum и др. Клубеньковые бактерии отдельных видов имеют некоторые разнообразия морфологических форм. Так, Rh.trifolii — толстые и короткие (до 2 мкм), покрытые слизью палочки; Rh. leguminosarum – палочки длиной 3,5-4 мкм; Rh.lupini — сильно изогнутые, крупные, покрытые слизью палочки. Неодинаковые у бобовых растений и формы, и размеры клубеньков, а также расположение их на корнях. У одних бобовых растений (горох, клевер, вика) клубеньки образуются в виде небольших вздутий на различных разветвлениях корней; у других (люпина) — имеют вид крупных бородавчатых наростов на главном корне. Клубеньковые бактерии имеют очень большое сельскохозяйственное значение, так как, усваивая азот из воздуха, они способствуют повышению урожайности сельскохозяйственных и особенно бобовых культур. Еще один пример симбиотических азотфиксаторов – это актиномицеты рода Frankia, образующие симбиоз с растениями из семейства Лоховые (Elaeagnaceae): облепиха (Hippophae), лох (Elaengnus), восковница (Myrica). Третий пример симбиоза растений с диазотрофами – это симбиоз цианобактерий с папоротниками или мхами. Симбиотический комплекс водного папоротника Azolla и цианобактерии Anabaena имеет большое сельскохозяйственное значение: заселение рисовых плантаций этим папоротником резко повышает урожайность риса. К азотфиксации способны и очень многие свободноживущие почвенные бактерии: Azotobacter, Clostridium, Beijerinckia, Bacillus, Desulfovibrio, Corynebacterium, Arthrobacter, Hydrogenomonas, Mycobacterium, Pseudomonas, Spirillum, Deria. Самые распространенные и изученные среди них – анаэробные бактерии рода Clostridium и аэробы Azotobacter и Beijerinckia. Azotobacter – аэробная неспорообразующая грамотрицательная бактерия. Культуры азотобактера в лабораторных условиях отличаются полиморфизмом. Молодые клетки подвижны; они имеют многочисленные или единичные жгутики. В старых культурах клетки азотобактера покрываются плотной слизистой оболочкой (капсулой), образуя цисты. Они могут прорастать, давая начало молодым клеткам. Clostridium — грамположительные, облигатно анаэробные палочковидные бактерии, способных продуцировать эндоспоры. Род включает как свободно живущие виды (например, Clostridium pasteurianum), так и патогенные, например, возбудители столбняка (Clostridium tetani), газовой гангрены (Clostridium perfringens) и ботулизма (Clostridium botulinum). Приготовление препарата Rhizobium Раздавить пинцетом клубенек с корней сои и нанести выделившийся сок на предметное стекло. Окрасить метиленовым синим, накрыть покровным стеклом и микроскопировать. Приготовление препарата Azotobacter На середину предметного стекла наносят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и микроскопируют. На черном фоне видны неокрашенные микробы, капсулы. Мазок, окрашенный тушью, фиксируют в пламени спиртовки. После промывания водой красят 5-10 мин карболовым раствором фуксина и вновь промывают, а затем высушивают. На черном фоне видны красные или фиолетовые бактерии и неокрашенные капсулы. Аммонификация Аммонификация – распад азотсодержащих органических соединений с высвобождением NH₃. Аммонификации могут подвергаться белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, мочевая кислота, мочевина, хитин. В процессе аммонификации трудноусвояемый азот органических соединений почвы (гумуса, органических удобрений, растительных остатков, отмерших тел животных и микроорганизмов) переходит в доступную для растений форму. Аммонификация белков осуществляется широко распространёнными в почве гнилостными бактериями, а также некоторыми актиномицетами и грибами. Выделяющийся при аммонификации аммиак частично используется самими микроорганизмами, а большая часть его нейтрализуется в почве органическими и неорганическими кислотами с образованием аммонийных солей. В процессе гниения участвуют аэробные бактерии – B. subtilis, B. mesentericus, Serratia marcescens, бактерии рода Proteus; грибы рода Aspergillus, Mucor, Penicillium; анаэробы – C. sporogenes, C. putrificum; уробактерии – Urobacillus pasteuri, Sarcina ureae, расщепляющие мочевину. Выявление аммонифицирующих бактерий осуществляют посевом из соответствующего разведения (четыре-пять) на мясо-пептонном агаре (МПА), мясо-пептонном бульоне (МПБ) или пептонной воде. О развитии аммонифицирующих бактерий судят по помутнению среды и появлению на поверхности пленки. В целях более точной оценки аммонифицирующей активности бактерий анализируют выделение аммиака (NH₃). Аммиак выявляют в атмосфере и субстрате. Выделяющийся NH₃ окрашивает подвешенную в пробирке красную лакмусовую бумажку в синий цвет. Накопление NH₃ в субстрате устанавливают при помощи реактива Несслера. На фарфоровую пластинку с лунками или предметное стекло помещают каплю субстрата, затем вносят каплю реактива Несслера. При большом количестве NH₃ образуется коричневый или буроватый осадок, при небольшом — оранжевая или желтая окраска. Бактерии, способные к аммонификации мочевины, — уробактерии, выявляют по выделению аммиака на средах, содержащих мочевину, среде Федорова, среде Зенгена. Среда Федорова Состав (в граммах на 1 л  дистиллированной воды): K или Na — виннокислый или Na яблочнокислый — 5,0; мочевина — 50,0; K₂HPO  — 0,5; MgSO₄·7H₂O — 0,2. В термостойкую плоскодонную либо коническую колбу помещают 1 л водопроводной воды. Вносят соли, кроме мочевины. Среду стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С, давлении 101,3 кПа в течение 20 мин. В стерильную среду добавляют раствор мочевины, предварительно пропущенный через бактериальный фильтр. Среду разливают по 30 мл в конические колбы. Срок хранения среды — не более 3 мес; в холодильнике — не более 7 дней. Среда Зенгена Состав (в граммах на 1 л  водопроводной воды): мочевина — 30; K₂HPO₄ — 0,5; лимоннокислый кальций — 10. рН среды — около 7,0. Среду стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С, давлении 101,3 кПа в течение 20 мин. Мочевину стерилизуют отдельно сухим жаром при температуре 106 °С в течение 30 мин и затем вводят в стерильную среду. Срок хранения среды — не более 3 мес; в холодильнике — не более 7 дней. Вода пептонная Состав (в граммах на 1 л водопроводной воды): пептон — 5,0; K₂HPO₄ — 1,0; KH₂PO₄ — 1,0; MgSО₄·7H₂O — 0,5; NaCl — 0,5. В термостойкую плоскодонную либо коническую колбу помещают 1 л водопроводной воды, вносят 5 г пептона и кипятят в течение 15 мин. В горячую жидкость вносят соли. Доводят рН до 7,0. После растворения солей раствор тщательно взбалтывают и фильтруют до полной прозрачности. Фильтрат собирают в коническую колбу, химический стакан. Среду разливают в пробирки по 6 мл и стерилизуют в автоклаве в течение 25 мин при давлении 101,3 кПа. Срок хранения среды — не более 2 мес; в холодильнике — не более 5 дней. Мясо-пептонный (агар) бульон 10 г пептона и 5 г хлористого натрия добавляют к 1 л мясной воды. Устанавливают рН 7,0-7,2, кипятят, фильтруют через бумажный фильтр. Стерилизуют при температуре (121+1) °С в течение 20 мин. При выпадении осадка в мясо-пептонном бульоне его вторично фильтруют с последующей стерилизацией. Для приготовления мясо-пептонного агара в 1 л мясо-пептонного бульона перед стерилизацией добавляют 15-20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. Устанавливают рН 7,0-7,2, разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин. Задание.

1. Приготовить препарат клубеньковых бактерий.
2. Приготовить окрашенный препарат Azotobacter.
3. Приготовить препарат аммонификаторов.
4. Провести качественную реакцию на аммонификацию с реактивом Несслера.
5. Провести качественную реакцию на аммонификацию с лакмусовой бумажкой.