Лабораторная работа по дисциплине «Микробиология» для ВГУ

Лабораторное занятие 13. Брожение: молочнокислое, маслянокислое, спиртовое

Брожение: молочнокислое, маслянокислое, спиртовое

Цели занятия:

1. Ознакомиться с различными типами брожения: биохимией процесса, возбудителями, применением данных процессов в деятельности человека;
2. Микроскопировать возбудителей спиртового, молочнокислого и маслянокислого брожения;
3. Провести качественные реакции на продукты спиртового, молочнокислого и маслянокислого брожения.

Материалы и оборудование: микроскопы, предметные стекла, покровные стекла, спиртовки, спирт, культура дрожжей, колба емкостью 250 мл, 10 % раствор сахарозы, пробка с изогнутой трубкой, водяная баня (35–40 °С), пробирка с насыщенным раствором Са(ОН)₂, 1% раствор фенола, 1% раствор хлорного железа, кефир, капустный рассол, накопительная культура клостридий, раствор Люголя. Прокариоты могут получать энергию двумя путями: за счет дыхания или за счет брожения. Брожение – это анаэробный процесс превращения органических веществ, при котором АТФ образуется за счет субстратного фосфорилирования, а продукты расщепления субстрата могут одновременно служить как донорами, так и акцепторами водорода. В зависимости от конечного продукта различают спиртовое, молочнокислое, маслянокислое, муравьинокислое, пропионовокислое брожение. Спиртовое брожение Общее уравнение спиртового брожения можно записать следующим образом: С₆Н₁₂О₆ + 2 АДФ + 2 Ф_н → 2 СН₃СН₂ОН + 2 СО₂ + 2 АТФ Энергетический выход спиртового брожения составляет две молекулы АТФ на одну молекулу глюкозы. Спиртовое брожение вызывают различные микроорганизмы. Это могут быть прокариоты (Zymomonas, Erwinia, Sarcina) и эукариоты (Aspergillus, Saccharomyces). В отечественной промышленности для производства спирта и в хлебопечении чаще всего используют дрожжи Saccharomyces. В Японии для производства рисовой водки сакэ используют плесневый гриб кодзи (Aspergillus oryzae), а в Мексике используют Zymonomonas mobilis для сбраживания сока агавы в ходе приготовления текилы. При изучении брожения на дрожжах Карл Нейберг показал, что при добавлении особых химических веществ состав продуктов брожения меняется. В соответствии с этим выделяют три формы сбраживания по Нейбергу:

1. классическая.
2. с бисульфитом натрия C₆H₁₂O₆ + NaHSO₃ → CH₃CHOHSO₃Na + CO₂ + CH₂(OH)CH(OH)CH₂(OH).
3. с подщелачиванием среды 2 C₆H₁₂O₆ + H₂O → C₂H₅OH + CH₃COOH + 2 CO₂ + 2CH₂(OH)CH(OH)CH₂(OH).

Вторая форма сбраживания по Нейбергу используется в промышленности для получения глицерина. Наличие третьей формы сбраживания по Нейбергу следует учитывать при производстве вин. Нужно контролировать рН, поскольку при подщелачивании среды начинается образование уксусной кислоты. Также для дрожжей были открыты эффекты Пастера  и Кребтри.

• Эффект Пастера: В аэробных условиях брожение прекращается и начинается процесс дыхания.
• Эффект Крэбтри: В аэробных условиях может идти процесс брожения, но при определенных условиях: необходима высокая концентрация сахара (1,5 — 2,5 %).

Определение продуктов спиртового брожения Определение углекислого газа В колбу емкостью 250 мл наливают 50 мл 10 % раствора сахарозы вносят 10 мл исследуемой дрожжевой суспензии. Колбу плотно закрывают пробкой с изогнутой трубкой и помещают на водяную баню (35–40 °С). Нижний конец трубки погружают в пробирку с насыщенным раствором Са(ОН)₂ (рис. 10). Через несколько минут в пробирке с известковой водой начинают поступать пузырьки газа. Следят за выделением пузырьков и помутнением жидкости. Известковая вода начинает интенсивно мутнеть за счет образования карбоната кальция. Задание.

1. приготовить препарат основного возбудителя спиртового брожения – дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
2. провести качественную реакцию на углекислый газ.

Молочнокислое брожение При молочнокислом брожении пируват, образующийся при катаболизме глюкозы, восстанавливается NADH-зависимой дегидрогеназой до лактата (молочной кислоты), что и дало название данному типу брожения. При молочнокислом брожении углеводы могут катаболизироваться разными способами, в связи с чем принято выделять «гомоферментативное брожение» и «гетероферментативное брожение». При гомоферментативном брожении глюкоза метаболизируется по пути гликолиза, а при гетероферментативном – по пентозофосфатному пути. В случае гомоферментативного брожения из одной молекулы глюкозы образуется две молекуля АТФ, и единственным конечным продуктом является молочная кислота: С₆Н₁₂О₆ + 2 АДФ + 2 Ф_н → 2 СН₃СНОНСООН + 2 АТФ Такой тип брожения характерен для Lactobacillus acidophilus, L.delbrueckii, L.salivarius, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus lactis и др. При гетероферментативном брожении помимо молочной кислоты образуется ряд других продуктов: уксусная кислота, этанол и углекислый газ. Именно за счет гетероферментативного брожения при производстве кефира в нем может содержаться до 2% этанола. Гетероферментативные молочнокислые бактерии делятся на факультативных (L.casei, L.plantarum, L.sake, Leuconostoc mesenteroides и др.) и облигатных (Lactobacillus brevis, L.kefir, L.fermentum и др.). У первых имеется полный набор ферментов гликолиза, однако адаптивно не синтезируются два ключевых фермента: фруктозо-1,6-бисфосфат-альдолаза и триозофосфатизомераза. В случае облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий данные ферменты полностью отсутствуют. Гетероферментативные молочнокислые бактерии рода Bifidobacterium преобладают в микробиоте желудочно-кишечного тракта грудных детей, и продукты осуществляемого ими брожения подавляют рост гнилостной микрофлоры. В коровьем молоке отсутствует N-ацетилглюкозамин, который является для этих бактерий незаменимым фактором роста. В настоящее время при дисбактериозе, вызванном, например, приёмом антибиотиков, назначают пробиотики, содержащие молочнокислые бактерии. Кроме того, бактерии рода Lactobacillus, обитающие во влагалище, за счёт образования молочной кислоты предотвращают размножение патогенной микрофлоры Молочнокислое брожение используется в приготовлении различных продуктов на основе молока. Для приготовления сметаны используются мезофильные бактерии Streptococcus lactis и Streptococcus cremoris, йогуртов — термофильные Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, ацидофилина — Lactobacillus acidophilus, творога, мягких сыров и сливочного масла — Lactobacillus casei, которая вызывает сворачивание белка казеина. Для производства кефира используется симбиотический комплекс из лактобактерий, стрептококков и дрожжей («кефирный гриб»). Спонтанное образование простокваши вызывает Lactobacillus delbrueckii, постоянно присутствующая в молоке. Поскольку молочная кислота является естественным консервантом, молочнокислое брожение используется при квашении овощей, засолке огурцов, в заквасках для ржаных сортов хлеба, при производстве высших сортов сырокопчёных колбас, а также для получения чистого лактата. С помощью молочнокислого брожения осуществляют заготовку кормов путем силосования. Качественная реакция на молочную кислоту Принцип метода. Молочная кислота с реактивом Уффельмана (фенол + хлорное железо) дает желто-зеленое окрашивание, вследствие образования молочно-кислого железа. Порядок выполнения работы. В две пробирки наливают по 1 мл 1% раствора фенола и добавляют по каплям 1% раствор хлорного железа до появления фиолетовой окраски. В одну из пробирок добавляют по каплям кефир, а в другую капустный рассол до появления желто-зеленой окраски. Изменение окраски свидетельствует о наличии молочной кислоты. Задание.

1. приготовить препараты молочнокислых бактерий из кефира, йогурта, капустного рассола.
2. провести качественную реакцию на молочную кислоту с реактивом Уффельмана.

Маслянокислое брожение Маслянокислое брожение протекает в соответствии с уравнением: 4 С₆Н₁₂О₆ + 3 АДФ + 3 Ф_н → 3 СН₃СН₂СН₂СООН + 8 Н₂ +2 СН₃СООН + 8 СО₂ +3 АТФ Энергетический выход маслянокислого брожения составляет три молекулы АТФ. Возбудители маслянокислого брожения принадлежат к роду Clostridium. Это облигатные анаэробы с метаболизмом исключительно бродильного типа. Способны сбраживать углеводы, спирты, аминокислоты, пурины и ряд других соединений. По используемым субстратам клостридии подразделяются на сахаролитические (гидролизуют полигликозиды: крахмал, пектин и целлюлозу) и протеолитические (гидролизуют белки и пептиды). К сахаролитическим клостридиям относится C.pasteurianum, к протеолитическим – C.hystoliticum. Некоторые клостридии могут быть одновременно сахаролитическими и протеолитическими. Получение накопительной культуры клостридий

1. Нарезать небольшими ломтиками нечищеный сырой картофель.
2. Колбы объемом 50 мл заполнить ломтиками картофеля на 1/3.
3. Помещают в колбы по 1 г почвы.
4. Для нейтрализации среды (препятствует закислению среды) прибавить небольшое количество карбоната кальция (CaCO₃) или мела.
5. Смесь залить кипятком на 2/3 и закупорить пробкой с газоотводной трубкой.
6. На газоотводную трубку надеть пробирку для сбора газов и поместить в воду.
7. Инкубировать систему в термостате при температуре +32⁰С в течение 2-7 суток

Качественные реакции на маслянокислое брожение. Качественная реакция на масляную кислоту. Получение маслянокислого железа (реакция с FeCl₃). Масляная кислота реагирует при нагревании с FeCl₃ с образованием маслянокислого железа. В пробирку наливают 3-5 мл сброженной жидкости, добавляют 1-2 мл 5%- ного хлорида железа и нагревают на пламени. Реакция идет по уравнению: CH₃(CH₂)₂COOH + FeCl₃ = [CH₃(CH₂)₂COO]Fe + 3HCl Раствор маслянокислого железа в отраженном свете приобретает буровато-коричневое окрашивание, а в проходящем свете — кроваво-красное. Качественная реакция на водород Снимают пробирку для сбора газов с газоотводной трубки, держа ее донышком вверх. К горлышку пробирки подносят горящую спичку. Водород взрывается с небольшим хлопком. Микроскопическое исследование маслянокислых бактерий В исследовании жидкости при микроскопировании обнаруживают главным образом Clostridium pasteurianum, подвижные палочки с закругленными концами, одиночные и парные. В клетках этих бактерий содержится гранулеза. В старых культурах у одного из концов клетки обнаруживают спору. Для определения гранулез в клетке бактерий готовят препарат «Раздавленная капля».

1. На центр чистого обезжиренного предметного стекла пипеткой наносят каплю исследуемой жидкости. Каплю суспензии берут со дна пробирки трубочкой.
2. Этой же пипеткой равномерно, очень тонким слоем распределяют суспензию на 1/5 центральной части поверхности предметного стекла.
3. На предметное стекло наносят каплю концентрированного раствора Люголя и выдерживаю в течение 30 с. Промывают водой и накрывают покровным стеклом.
4. Микроскопируют при увеличении 100х с масляной иммерсией. Гранулеза окрашивается раствором Люголя в синий цвет.

Задание.

1. Провести качественную реакцию на масляную кислоту.
2. Провести качественную реакцию на водород.
3. Приготовить и микроскопировать окрашенный препарат маслянокислых бактерий.