Лабораторная работа по дисциплине «Микробиология» для ВГУ

Лабораторное занятие 2. Морфология микроскопических грибов

Морфология микроскопических грибов

Цели занятия:

1. Ознакомиться с морфологией микроскопических грибов;
2. Приготовить препараты «раздавленная капля» для дрожжей, мукора, пеницилла, аспергилла;
3. Микроскопировать фиксированные препараты аспергилла, пеницилла и шизосахаромицет.

Материалы и оборудование: микроскопы, предметные стекла, покровные стекла, промывалки с водой, микробиологические иглы, микробиологические петли, спиртовки, спирт, спички, чашки Петри с культурами мукора, аспергилла и пеницилла, суспензия дрожжей, фиксированные препараты аспергилла, пеницилла и шизосахаромицет. Микроскопические грибы – эукариотические организмы. К ним относятся дрожжи и плесени. Как и все грибы, они являются аэробными микроорганизмами и по типу питания относятся к хемоорганогеторотрофам. Большинство грибов – сапрофиты, но некоторые вызывают заболевания и являются паразитами. Тело грибов – это грибница, или мицелий, состоящий из ветвящихся нитей, называемых гифами. Диаметр гифов, колеблется от 5 до 50 мкм. В зависимости от строения мицелия грибы делятся на многоклеточные одноядерные и одноклеточные многоядерные. Мицелий может быть септированный (гифы разделены перегородками и имеют общую оболочку) и несептированный (представлен разветвлениями одной гифы без перегородок). Тканевые формы дрожжей могут быть представлены псевдомицелием, его образование — результат почкования одноклеточных грибов без отхождения дочерних клеток. Общую оболочку псевдомицелий, в отличие от истинного, не имеет. Размножаются микроскопические грибы бесполым и половым путем. Оба способа связаны с образованием спор. Бесполое размножение осуществляется также фрагментами мицелия. Грибы, способные к половому размножению, относятся к совершенным грибам, неспособные – к несовершенным. Спорообразующие структуры грибов называются спорофорами. Если терминальный конец спорофоры увеличивается по мере роста в размере, а затем превращается в закрытое вместилище спор, то это вместилище спор называется спорангием и содержит спорангиеспоры. Эти споры являются эндоспорами (внутренними). Спорофоры, формирующие свободные споры, называются конидиефорами (или конидиеносцами), а свободные споры называются экзоспорами (наружными), или конидиями. Конидиеносцы представляет собой особые ветви мицелия, отличающиеся по строению и характеру ветвления от остальных гиф. Для некоторых видов грибов характерно тесное сплетение нескольких конидиеносцев в пучок. Такое сплетение называется коремией. Есть грибы, конидиеносцы у которых заключены в округлое тело – пикниду. Она имеет твердую оболочку темного цвета и узкое отверстие наверху для выхода конидий. Пикнида защищает конидиеносцы и конидии от неблагоприятных воздействий внешней среды. Для плесневых грибов цвет спор определяет и цвет всего гриба. Например, у мукора серые споры, у аспергилла черные, у пеницилла зеленые. Соответственно они выглядят как серая, черная и зеленая плесень. Для приготовления препарата плесневых грибов очень осторожно (чтобы не разрушить органов спороношения) препаровальной иглой или ботаническим пинцетом снимают кусочек пленки гриба и переносят его в каплю воды, предварительно нанесенную на предметное стекло. Препарат осторожно, слегка придавливая, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом на малом увеличении. При этом увеличении хорошо различается строение органов спороношения плесневых грибов. Для подробного изучения отдельных деталей строения (гиф, сумок и т.д.) препарат рассматривают на большом увеличении. При этом обязательно следует регулировать освещение с помощью диафрагмы для получения более четкого изображения рассматриваемых деталей. Плесневые грибы. 1)    Одноклеточные многоядерные. У одноклеточных многоядерных грибов мицелий не поделён перегородками и представлен одной гигантской многоядерной разветвлённой клеткой. Мукор (Mucor sp). Род Mucor (рис. 6 А) объединяет более 50 видов грибов. Его представители могут развиваться в верхних слоях почвы, продуктах питания. Некоторые представители рода вызывают грибковые заболевания (мукоромикоз). Мукоромикоз относят к редким заболеваниям человека, но, возникнув, он может быть потенциально летальным. Микоз обычно возникает в результате аэрогенной инфекции или попадания спор с пищей; однако чаще развивается на фоне других болезней (туберкулеза, бруцеллеза, болезней крови и особенно диабета с выраженным сопутствующим ацидозом) и др. Помимо человека, известны заболевания этим микозом у животных — собак, свиней, крупного рогатого скота, лошадей, морских свинок. Начало болезни часто связывают с вдыханием элементов грибов; в последующем развиваются микотический бронхит, реже пневмония («легочной мукороз»). При пневмомикозе на вскрытии обнаруживались обширные казеозные участки, вокруг которых наблюдалось разрастание фиброзной ткани. В процесс вовлекаются также лимфатические узлы, плевра, иногда диафрагма. Микроскопически: очаги поражения представлены некротизированной тканью, окружены небольшим количеством палочкоядерных лейкоцитов, плазматическими клетками и эозинофилами; встречаются гигантские клетки. В некротизированной ткани, а часто и в гигантских клетках обнаруживаются крупные ветвящиеся нити мицелия гриба. Помимо изменений в дыхательном тракте, как и при аспергиллезе, наблюдаются поражения области глазной орбиты, придаточных пазух с последующим прорастанием гриба в полость черепа, что может вызвать поражения оболочек и вещества головного мозга (в полном смысле этого понятия — «человек проплесневел»). Развитие мукоромикотического менингита возможно и в результате занесения гриба при спинномозговой пункции. Описаны также мукорозные поражения желудка, кишечника («гастроинтестинальный мукороз»), почек. Прорастая стенки артерий, вен и лимфатических сосудов, мицелий гриба образует «сплетения» в их просвете, в результате чего развиваются тромбозы и инфаркты. При генерализации процесса течение заболевания принимает бурный характер и быстро заканчивается смертью. Метастатические очаги при генерализованном мукорозе обнаруживаются во внутренних органах и в головном мозгу. К редким проявлениям относят мукороз кожи (с покраснением, уплотнением ее, некрозом и формированием язв с черными корками). Плесневые грибы могут осложнять различные травмы, раны, ожоговые поверхности, трофические язвы, что значительно отягощает их течение. В срезах ткани возбудитель мукороза обнаруживается в виде несептированного широкого мицелия толщиной от 4 до 20 мкм. Иногда на концах мицелия видны шаровидные утолщения, заполненные спорами (спорангиями). При окраске срезов ткани гематоксилинэозином стенки мицелия и спор окрашиваются гематоксилином, а протоплазма — эозином. Более четко грибы контурируются при докраске фона тионином. Для окончательного диагноза необходимо микроскопическое изучение мазков-отпечатков и выделение гриба в чистой культуре. Тканевая реакция при мукорозе сходна с изменениями при аспергиллезе. В отличие от аспергилл, мицелий мукоров значительно толще и не септирован. Однако, несмотря на эти различия, ведущая роль в идентификации мукорозных грибов принадлежит методу выделения их в чистой культуре. В ряде случаев поражения при мукорозе могут сочетаться с процессами, вызванными другими плесневыми или дрожжеподобными грибами. Многоклеточные одноядерные. Аспергилл (Aspergillus sp.) Род аэробных плесневых грибов, включающий в себя несколько сотен видов. Мицелий у молодых грибов белого цвета. С возрастом окраска мицелия изменяется в зависимости от цвета спор. Некоторые грибы из рода Aspergillus: Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus – могут вызывать аспергиллезы – грибковые заболевания кожи, ногтей, слизистых оболочек, уха, глаза, легких и других внутренних органов. Заражение чаще всего происходит ингаляторным путем, через желудочно-кишечный тракт и нередко через поврежденную кожу. Инфицирование может происходить также от различных птиц (в том числе от домашних) и сельскохозяйственных животных. Чаще аспергиллез возникает при снижении сопротивляемости организма у людей, страдающих хроническими болезнями. На коже могут быть высыпания в виде дерматита, язвенных и абсцедирующих пиодермий, а также пузырьковая, узелковая сыпь или распространенная эритродермия. При поражении легких отмечается клиника бронхита, пневмонии и туберкулеза легких. Диагностика аспергиллеза осуществляется микроскопическими исследованиями (обнаружение спор и мицелия гриба в патологическом материале) и бактериологическими (выделение чистой культуры гриба). Пеницилл (Penicillium sp.) Один из наиболее широко распространённых в мире родов грибов, представители которого обнаруживаются в самых различных местах — в почве, на растениях, в воздухе, в помещениях, на пищевых продуктах, в морях. К роду относят продуцентов антибиотика пенициллина — среди них P. chrysogenum, являющийся одним из самых распространённых грибов в мире. Другой крайне широко распространённый вид рода — P. citrinum. Гифы неправильно ветвящиеся, септированные, обычно неокрашенные. Конидиеносцы септированные, на конце несут так называемую кисточку (лат. penicillus) — мутовку фиалид (одноярусная кисточка) или мутовку метул, несущих по мутовке конидиогенных клеток каждая (двухъярусная кисточка). Сам конидиеносец может дополнительно ветвиться, в результате образуются трёх- и четырёхъярусные (иногда и с большим числом ярусов) кисточки. Большинство видов — исконно почвенные сапротрофы, меньшая доля — оппортунистические паразиты растений, поражающие ослабленные всходы и длительно хранящиеся плоды растений. Встречаются и на прочих органических субстратах, пищевых продуктах. Среди видов рода известно множество продуцентов природных лекарственных препаратов, в том числе антибиотиков. Первый известный науке бактерицидный антибиотик — пенициллин, продуцируется пенициллами Вещества группы пенициллинов обладают активностью по отношению к грамотрицательным и многим грамположительным бактериям, ингибируя синтез клеточной стенки. Дрожжи Это внетаксономическая группа одноклеточных грибов, утративших мицелиальное строение в связи с переходом к обитанию в жидких и полужидких средах. Объединяет около 1500 видов. Дрожжи относятся к царству грибов (Mycota), отделу истинных грибов (Eumycota). В зависимости от того, способны ли дрожжи размножаться половым путем, их можно отнести к 2-м классам: классу аскомицетов и классу дейтеромицетов. Небольшая часть дрожжей относится к классу базидиомицетов. Размножение дрожжей зависит от условий жизнедеятельности дрожжевой клетки и от вида дрожжей. Вегетативное размножение происходит почкованием, реже – делением или почкующимся делением. Почкование – это процесс образования на клетке маленького бугорка – почки, которая постепенно увеличивается в размерах. В месте соединения почки с материнской клеткой постепенно образуется сужение – перетяжка. Когда почка достигает примерно одной трети размеров материнской клетки, ядро перемещается в перетяжку и здесь происходит его деление на 2 ядра. Одно из ядер переходит в почку, а другое остается в материнской клетке. Постепенно перетяжка ограничивает дочернюю клетку от материнской, затем слои перегородки разделяются, оставляя на материнской клетке почковой рубец. Почкованием обычно размножаются дрожжи овальной формы. Бинарное деление дрожжевой клетки происходит путем возникновения поперечной перегородки, которая, развиваясь, приводит к образованию двух дочерних клеток, идентичных родительской. Делением размножаются дрожжи цилиндрической формы. Почкующееся деление характерно для дрожжей лимоновидной формы. Вначале на полюсе возникает почка, которая после деления ядра ограничивается от материнской клетки перегородкой. Половое размножение Этим способом размножаются некоторые виды гаплоидных дрожжей. Перед спорообразованием такие гаплоидные клетки сливаются, в результате образуется диплоидная клетка, ядро которой делится путем мейоза с образованием четырех или восьми аскоспор. Половое размножение дрожжей осуществляется в неблагоприятных условиях. Некоторые виды дрожжей с давних пор используются человеком при приготовлении хлеба, пива, вина, кваса и др. В сочетании с перегонкой процессы брожения лежат в основе производства крепких спиртных напитков. Высушенные пивные дрожжи используют для производства лекарственных препаратов и БАД. Также существует ряд препаратов на основе Saccharomyces boulardii, поддерживающих и восстанавливающих флору желудочно-кишечного тракта. Некоторые виды дрожжей являются факультативными и условными патогенами, вызывая заболевания у людей с ослабленной иммунной системой. Дрожжи рода Candida являются компонентами нормальной микрофлоры человека, однако при общем ослаблении организма травмами, ожогами, хирургическим вмешательством, длительном применении антибиотиков, в раннем детском возрасте и в старости и т. д. грибы рода Candida могут массово развиваться, вызывая заболевание — кандидоз – молочницу, которая поражает слизистые оболочки половых органов, рта, а иногда и внутренних органов. В нормальных условиях в человеческом организме дрожжи рода Candida ограничиваются в своём развитии естественной бактериальной микрофлорой человека (лактобактерии и пр.), но при развитии патологического процесса многие из них образуют высокопатогенные сообщества с бактериями. Cryptococcus neoformans вызывает криптококкоз — инфекционное заболевание, характеризующееся поражением ЦНС лёгких, кожи, слизистых оболочек, особенно опасное для ВИЧ-инфицированных людей. Клетки C. neoformans окружены прочной полисахаридной капсулой, которая препятствует их распознаванию и уничтожению лейкоцитами. Дрожжи этого вида наиболее часто обнаруживаются в помёте птиц, при том что сами птицы не болеют. Род Malassezia включает облигатных симбионтов теплокровных животных и человека, не встречающихся нигде, кроме их кожных покровов. При нарушениях иммунитета вызывают питириаз (пёстрый лишай), фолликулит и себорейный дерматит. У здоровых людей при нормальном функционировании сальных желез Malassezia никак себя не проявляют и даже играют положительную роль, препятствуя развитию более опасных патогенов. Задание

1. Приготовить и микроскопировать препараты мицелиальных грибов: Mucor, Penicillium, Aspergillum.
2. Приготовить и микроскопировать препарат немицеллиального гриба Saccharomyces cerevisiae.
3. Микроскопировать фиксированный препарат Shizosaccharomyces ascospores.