Лабораторная работа по дисциплине «Микробиология» для ВГУ

Микроскопическая техника в микробиологии. Приготовление микроскопических препаратов Цели занятия:

1. Познакомиться с устройством и принципом работы светового микроскопа
2. Научиться готовить микроскопические препараты живых бактерий: висячая капля, раздавленная капля.
3. Научиться готовить микроскопические препараты убитых бактерий

Материалы и оборудование: микроскопы, предметные стекла, предметные стекла с лункой, покровные стекла, микробиологические петли, промывалки, спиртовки, спирт, спички, маркеры, культура сенной палочки. Устройство светового микроскопа. Микроскоп — это оптический прибор, позволяющий получить обратное изображение изучаемого объекта и рассмотреть мелкие детали его строения, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза. Разрешающая способность микроскопа дает раздельное изображение двух близких друг другу линий. Невооруженный человеческий глаз имеет разрешающую способность около 1/10 мм или 100 мкм. Лучший световой микроскоп примерно в 500 раз улучшает возможность человеческого глаза, т. е. его разрешающая способность составляет около 0,2 мкм или 200 нм. Разрешающая способность и увеличение не одно и тоже. Если с помощью светового микроскопа получить фотографии двух линий, расположенных на расстоянии менее 0,2 мкм, то, как бы не увеличивать изображение, линии будут сливаться в одну. Можно получить большое увеличение, но не улучшить его разрешение. Различают полезное и бесполезное увеличения. Под полезным понимают такое увеличение наблюдаемого объекта, при котором можно выявить новые детали его строения. Бесполезное — это увеличение, при котором, увеличивая объект в сотни и более раз, нельзя обнаружить новых деталей строения. Например, если изображение, полученное с помощью микроскопа, увеличить еще во много раз, спроецировав его на экран, то новые, более тонкие детали строения при этом не выявятся, а лишь соответственно увеличатся размеры имеющихся структур. В учебных лабораториях обычно используют световые микроскопы, на которых микропрепараты рассматриваются с использованием естественного или искусственного света. Наиболее распространены световые биологические микроскопы: БИОЛАМ, МИКМЕД, МБР (микроскоп биологический рабочий), МБИ (микроскоп биологический исследовательский) и МБС (микроскоп биологический стереоскопический). Они дают увеличение в пределах от 56 до 1350 раз. Стереомикроскоп (МБС) обеспечивает подлинно объемное восприятие микрообъекта и увеличивает от 3,5 до 88 раз. В микроскопе выделяют две системы: оптическую и  механическую. К оптической системе относят объективы, окуляры и осветительное устройство (конденсор с диафрагмой и светофильтром, зеркало или электроосветитель). Рассмотрим конструкцию световых микроскопов на примере микроскопа отечественного производства Микмед – 1 (рис.1). Объектив — одна из важнейших частей микроскопа, поскольку он определяет полезное увеличение объекта. Объектив состоит из металлического цилиндра с вмонтированными в него линзами, число которых может быть различным. Увеличение объектива обозначено на нем цифрами. В учебных целях используют обычно объективы х8 (х10) и х40. Иммерсионный объектив (х100), используется для изучения наиболее мелких объектов. Качество объектива определяет его разрешающая способность. Разрешающая способность – это наименьшее расстояние, на котором две ближайшие точки объектива воспринимаются раздельно. Для пучка лучей, параллельных оптической оси микроскопа, она определяется по формуле: Е=λ/А, где Е – разрешающая способность объектива, λ – длина волны источника света, А – апертура объектива. Для наклонных лучей разрешающая способность в 2 раза выше: Е = λ/2A. Длина волны лучей источника света в видимой части спектра может меняться от 0,4 мкм (400 нм) для фиолетовых лучей до 0,7 мкм (700 нм) для красных. Следовательно, чем короче длина волны лучей источника света и чем больше апертура объектива, тем выше разрешающая способность объектива микроскопа, т. е. тем более тонкие структуры мы сможем увидеть в микроскоп. При освещении объекта наклонными лучами разрешающая способность объектива микроскопа в 2 раза выше, чем при освещении прямо падающими лучами. Освещая препарат синими лучами (λ = 0,47 мкм), т. е. применяя в осветителе синий светофильтр, можно изучать более тонкие структуры, чем при освещении обычным белым светом. Пример: для объектива с A=1,4 при освещении белым светом (λ = 0,55 мкм) диаметр наименьшей видимой частицы при прямо падающем свете равен 0,39 мкм, при косом освещении – 0,20 мкм, а при освещении синим светом – 0,34 и 0,17 мкм, соответственно. Максимальное разрешение, которое можно получить при использовании светового микроскопа, 0,20 – 0,35 мкм. Увеличить разрешающую способность можно при использовании ультрафиолетового света (длина волны 0,26 – 0,28 мкм), что позволяет получить разрешение 0,13 – 0,14 мкм. Числовая, или нумерическая, апертура (А) объектива характеризует светособирательную способность и определяется по формуле A=n∙sinα, где n– показатель преломления среды между фронтальной линзой объектива и покровным стеклом; α – половинный угол входного отверстия объектива (угол, одна сторона которого совпадает с оптической осью, другая образована линией, соединяющей точку выхода лучей из объектива с границей действующего отверстия объектива) (рис. 2). Различают слабые объективы (А=0,02-0,25), средние объективы (А=0,3-0,65) и сильные объективы (А=0,7-1,6). Все объективы по способу применения делят на сухие и иммерсионные (от лат. Immersio – погружаю или окунаю). У сухих объективов между фронтальной линзой и рассматриваемым препаратом находится воздух. Воздух и стекло имеют разные показатели преломления света (соответственно 1,0 и 1,52), в результате чего лучи света, переходя из одной среды в другую, преломляются, рассеиваются, происходит частичное искажение рассматриваемых объектов (рис. 3). У иммерсионных объективов пространство между фронтальной линзой и препаратом заполнено, как правило, кедровым маслом или водой. Предметное стекло, стекло объектива и кедровое масло имеют почти одинаковый показатель преломления света (1,52 и 1,515), поэтому лучи, проходя из одной среды в другую, почти не преломляются, свет не рассеивается, рассматриваемые объекты не искажаются. Показатель преломления света, близкий к таковому стекла, имеют и другие вещества, которые используются в качестве иммерсионных составов: касторовое масло (1,48-1,49), гвоздичное масло (1,53), смесь касторового и гвоздичного масел (1,515). При работе с иммерсионными объективами следует соблюдать осторожность, чтобы при опускании тубуса не повредить линзу. Иммерсионную жидкость наносят между линзой и объективом в виде капли на поверхность покровного стекла препарата и, опуская затем тубус, погружают линзу в каплю иммерсии. Иммерсионную жидкость можно нанести и на поверхность линзы объектива либо по капле и на препарат, и на объектив. Главное требование — создание иммерсии без пузырьков воздуха. Окуляр устроен намного проще объектива. Он состоит из 2-3 линз, вмонтированных в металлический цилиндр. Между линзами расположена постоянная диафрагма, определяющая границы поля зрения. Нижняя линза фокусирует изображение объекта, построенное объективом в плоскости диафрагмы, а верхняя служит непосредственно для наблюдения. Увеличение окуляров обозначено на них цифрами: х7, х10, х15. Окуляры не выявляют новых деталей строения, и в этом отношении их увеличение бесполезно. Таким образом, окуляр, подобно лупе, дает прямое, мнимое, увеличенное изображение наблюдаемого объекта, построенное объективом. В зависимости от количества окуляров микроскопы подразделяют на монокуляры, бинокуляры и тринокуляры. Для определения общего увеличения микроскопа следует умножить увеличение объектива на увеличение окуляра. Осветительное устройство состоит из зеркала или электроосветителя, конденсора с ирисовой диафрагмой и светофильтром, расположенных под предметным столиком. Они предназначены для освещения объекта пучком света. Зеркало служит для направления света через конденсор и отверстие предметного столика на объект. Оно имеет две поверхности: плоскую и вогнутую. В лабораториях с рассеянным светом используют вогнутое зеркало. Электроосветитель устанавливается под конденсором в гнездо подставки. Конденсор состоит из 2-3 линз, вставленных в металлический цилиндр. При подъеме или опускании его с помощью специального винта соответственно конденсируется или рассеивается свет, падающий от зеркала на объект. Конденсоры тоже имеет определенную числовую апертуру. Если апертура конденсора меньше апертуры объектива, то возможности объектива, таким образом, используются в работе неполностью. Ирисовая диафрагма расположена между зеркалом и конденсором. Она служит для изменения диаметра светового потока, направляемого зеркалом через конденсор на объект, в соответствии с диаметром фронтальной линзы объектива и состоит из тонких металлических пластинок. С помощью рычажка их можно то соединить, полностью закрывая нижнюю линзу конденсора, то развести, увеличивая поток света. Кольцо с матовым стеклом или светофильтром уменьшает освещенность объекта. Оно расположено под диафрагмой и передвигается в горизонтальной плоскости. Механическая система микроскопа состоит из подставки, коробки с микрометренным механизмом и микрометренным винтом, тубуса, тубусодержателя, винта грубой наводки, кронштейна конденсора, винта перемещения конденсора, револьвера, предметного столика. Подставка — это основание микроскопа. Коробка с микрометренным механизмом, построенном на принципе взаимодействующих шестерен, прикреплена к подставке неподвижно. Микрометренный винт (микровинт) служит для незначительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива на расстояния, измеряемые микрометрами. Полный оборот микрометренного винта передвигает тубусодержатель на 100 мкм, а поворот на одно деление опускает или поднимает тубусодержатель на 2 мкм. Во избежание порчи микрометренного механизма разрешается крутить микрометренный винт в одну сторону не более чем на половину оборота. Тубус или трубка — цилиндр, в который сверху вставляют окуляры. Тубус подвижно соединен с головкой тубусодержателя, его фиксируют стопорным винтом в определенном положении. Ослабив стопорный винт, тубус можно снять. Револьвер предназначен для быстрой смены объективов, которые ввинчиваются в его гнезда. Центрированное положение объектива обеспечивает защелка, расположенная внутри револьвера. Тубусодержатель несет тубус и револьвер. Винт грубой наводки (макровинт) используют для значительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива с целью фокусировки объекта при малом увеличении. Предметный столик предназначен для расположения на нем препарата. В середине столика имеется круглое отверстие, в которое входит фронтальная линза конденсора. На столике имеются две пружинистые клеммы — зажимы, закрепляющие препарат. Кронштейн конденсора подвижно присоединен к коробке микрометренного механизма. Его можно поднять или опустить при помощи винта, вращающего зубчатое колесо, входящее в пазы рейки с гребенчатой нарезкой. Типы световой микроскопии В зависимости от свойств объекта свет изменяет свои физические свойства — цвет (длину волны), яркость (амплитуду волны), фазу, используются в современных микроскопах для создания контраста. Для микроскопии окрашенных объектов пользуются самым простым из известных микроскопов — так называемым обычным (рис. 1). С его помощью исследуются препараты живых бактерий и окрашенные препараты убитых бактерий. Этот метод часто применяется в медицине, например для диагностики в мазках влагалищных трихомонад. Темнопольная микроскопия обеспечивает наибольший возможный контраст изображения, но четкость его и полезное увеличение заметно ниже, чем при обычной микроскопии. Темнопольная микроскопия успешно применялась для изучения спирохет, лептоспир и других слабо окрашиваемых микроорганизмов. Технически самостоятельным вариантом темнопольной микроскопии является ультрамикроскопия, при которой мельчайшие изучаемые частицы освещаются мощным боковым пучком света и видны точками на черном фоне. Ультрамикроскопия позволяет подсчитывать частицы, оценивать их размеры и другие свойства. Применяется для изучения коллоидных растворов, аэрозолей, суспензий. В последние годы темнопольная микроскопия применяется все реже, так как появился контрастирующий прибор со значительно лучшими характеристиками — фазово-контрастный микроскоп. Луч, прошедший через фон образца, в идеальном случае не претерпевает никаких изменений. Он проходит через точно определенные участки объектива. Луч, прошедший через объект, подвергается дифракции, т. е. распадается на пучки убывающей интенсивности, которые выходят из объекта под разными углами. Другие свойства луча (амплитуда, длина волны, фаза) изменяются в различных степенях в зависимости от особенностей объекта. Почти все живые микроскопические объекты выглядят в обычном микроскопе едва заметными, прозрачными, потому что они почти не изменяют ни амплитуды, ни цвета прошедшего через них луча. Они изменяют только фазу его волны, но это изменение не улавливается ни глазом, ни фотопластинкой. Пучок лучей, дифрагированных объектом и сдвинутых им по фазе, проходит через те участки объектива, где не могут пройти прямые, недифрагированные лучи фона. Практически нетрудно определить, где именно пройдут эти лучи. Если накрыть этот участок одной из линз объектива полупрозрачной пластинкой, способной изменить фазу, интенсивность, цвет или все эти три свойства вместе, то изображение фона изменит свою фазу, уменьшится его яркость или преобразится цвет. Лучи, прошедшие через объект и отклоненные (дифрагированные) им, обойдут вложенную в объектив пластинку и, следовательно, не приобретут тех свойств, которые приобрели, пройдя через пластинку, лучи фона. В результате разница между лучами фона и объекта возрастет (рис. 4). Если разница фаз между лучами фона и объекта достигает 1/4 длины волны, то в конечном изображении возникает заметный для глаза и фотопластинки контраст: темный объект на светлом фоне или, наоборот, в зависимости от структуры пластинки, которую в этом случае называют «фазовой». Люминесцентная микроскопия широко применяется в научно-исследовательских и клинико-диагностических лабораториях. При этом живой объект обрабатывают специальными красителями, которые, будучи освещены синим, фиолетовым или ультрафиолетовым светом, начинают светиться, излучая более длинные волны (зеленые, желтые). Цвет возбужденного вторичного свечения зависит от химических свойств объекта и введенного в него красителя. Приготовление микропрепаратов В зависимости от цели исследования готовят препараты живых или убитых микроорганизмов. Препараты живых микроорганизмов позволяют получить представления о размере, форме, подвижности клеток, изучить их жизненный цикл. Однако эти препараты не предназначены для длительного хранения. В случае необходимости повторного использования готовят фиксированные препараты убитых микроорганизмов. Еще одно применение фиксированных препаратов – в медицине при работе с патогенами.

1. Препараты живых микроорганизмов.

А) Препарат «раздавленная капля» На обезжиренное предметное стекло прокаленной петлей наносят каплю стерильной воды, в которую той же петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры микроорганизма, взятой с твердой питательной среды. Из жидкой среды культуру берут вместе с каплей жидкости. Препарат накрывают покровным стеклом и микроскопируют сначала с объективом 10Х (при этом фокусируются между покровным и предметным стеклом, ориентируясь по пузырям воздуха), а затем с объективом 40Х. На последнем увеличении уже можно рассмотреть морфологию клеток. Препарат легко и быстро готовить, благодаря чему он получил широкое применение при первичной диагностике микроорганизмов. Однако он высыхает через 10-15 минут, поэтому для длительного наблюдения за живыми клетками не подходит. Б) препарат «висячая капля» Для приготовления препарата в центр покровного стекла наносят каплю исследуемого материала. Затем покровное стекло быстро поворачивают каплей вниз и кладут на предметное стекло с лункой, так чтобы капля оказалась посередине лунки. Чтобы предметное и покровное стекло были плотно прилегали друг к другу, их склеивают между собой водой или вазелином. Капля оказывается висящей в герметически изолированном пространстве (рис. 5). При малом увеличении микроскопа (10Х) находят край капли, далее исследуют препарат при большом увеличении (40Х). Чтобы ограничить подвижность микроорганизмов, каплю исследуемой жидкости можно поместить в расплавленный и остуженный до t° 45° агар. Препарат «висячая капля» используется для многодневных наблюдений за исследуемым объектов, например, при изучении жизненного цикла микроорганизмов.

2. Препараты убитых микроорганизмов.

Для приготовления препарата убитых микроорганизмов на нижней стороне предметного стекла маркером рисуют кружок диаметром 2 см. Затем готовят мазок: стерильно отбирают микробиологической петлей каплю исследуемого материала и размазывают внутри кружка. Высушивают на воздухе. Фиксируют препарат в пламени спиртовки. Для этого трижды проводят стекло с мазком через пламя. Зафиксированный препарат микроскопируют при увеличении 40Х. Для фиксации микроорганизмов можно использовать не только термический метод в пламени спиртовки, но и химические методы: при помощи 96 %-ого спирта, смеси спирта и эфира (смесь Никифорова), ацетона, формалина, осмиевой кислоты. Фиксация проводится для того, чтобы убить микроорганизмы и прикрепить их к предметному стеклу. Фиксированные препараты микроскопируются без покровного стекла. Задание

1. Приготовить препарат «раздавленная капля»
2. Приготовить препарат «висячая капля»
3. Приготовить фиксированный препарат