Лабораторная работа по дисциплине «Микробиология» для ВГУ

Лабораторное занятие 5. Посев микроорганизмов из почвы, воды, воздуха

Посев микроорганизмов из почвы, воды, воздуха

Цели занятия:

1. Ознакомиться с понятием и принципами определения микробной обсемененности;
2. Ознакомиться с типами питательных сред и методами стерилизации;
3. Провести посев микроорганизмов из почвы, воды и воздуха.

Материалы и оборудование: стерильные чашки Петри, стерильные пробирки, стерильные пипетки, спиртовки, спирт, спички, штативы, колбы с водой для разведений, пробирки с водой для разведений, пробирки с РПА, маркеры, водяная баня для пробирок. Одним из санитарно-гигиенических показателей окружающей среды является микробная обсемененность, то есть количество содержащихся в субстрате микроорганизмов. Микробную обсемененность объекта выражают в виде титра или индекса. Титр — это наименьшее количество исследуемого субстрата, в котором обнаружен микроорганизм. Индекс — количество клеток искомого микроорганизма, обнаруживаемого в определенном объеме исследуемого субстрата, например, в 1000 мл воды, в 1 г почвы, в 1 г пищевых продуктов. Пересчет титра в индекс и обратно производят следующим образом: Принято считать, что чем выше общая микробная обсемененность объекта внешней среды, тем больше вероятность присутствия в них патогенных бактерий. В санитарно-бактериологических лабораториях для количественного учета микроорганизмов применяют в основном прямой подсчет микроорганизмов и определение микробного числа. Реже используют титрационный посев (метод предельных разведений). Прямой подсчет микроорганизмов. С помощью этого метода учитывают общее количество живых и мертвых клеток. Метод простой и доступный для использования в санитарно-бактериологических лабораториях, но имеет следующие недостатки. С помощью этого метода трудно различить микроорганизмы и инородные частицы, точно определить количество микроорганизмов, так как они часто образуют большие скопления, неразбивающиеся конгломераты (комочки), невозможно дифференцировать живые микроорганизмы и мертвые, хотя санитарное значение живых и мертвых бактерий неодинаково. Микробное число. Этот метод позволяет учитывать только живые микроорганизмы. Микробным числом называют количество колоний, которые вырастают на мясопептонном агаре (МПА) при посеве 1 мл или 1 г субстрата и культивировании при 37°С в течение 24— 48 ч (или при 22°С 72 ч). При определении микробного числа учитывают в основном колонии аэробных метатрофных (сапрофитных) мезофильных микробов, использующих в качестве источников азотного питания белок и продукты его распада. Эти микробы являются основными потребителями органических веществ, вносимых в почву и воду с различными отходами промышленных предприятий, выделениями людей и животных. Количество этих микроорганизмов, как правило, увеличивается в процессе загрязнения внешней среды и уменьшается при ее самоочищении. Следовательно, бактериальное обсеменение субстрата, определяемое этим методом, оказывается значительно меньше, чем при прямом подсчете. Это объясняется также тем, что мертвые клетки при высеве не дадут роста на питательной среде; не растут живые клетки, утратившие способность к размножению; не всегда разбиваются бактериальные конгломераты и одна колония вырастает из нескольких клеток; отсутствуют питательные среды, обеспечивающие рост микроорганизмов всех видов; не вырастут анаэробы, так как культивирование проводят в аэробных условиях; не дадут роста термофилы и психрофилы (посевы выращивают при 37°С, т. е. при температуре, благоприятной для развития мезофильных микроорганизмов). Следовательно, количество микробов, вырастающих на МПА, оказывается во много раз меньше, чем их истинное содержание в высеваемом объекте. Мы будем проводить учет микроорганизмов из разных субстратов путем посева на твердые питательные среды. Типы питательных сред. Питательная среда – это однокомпонентный или многокомпонентный субстрат, применяемый для культивирования микроорганизмов. Она должна обладать следующими свойствами:

1. Удовлетворять потребности микроорганизмов в питательных веществах
2. Быть изотоничной для микробной клетки; то есть осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальная среда, соответствующая 0,5 % раствору натрия хлорида.
3. Быть стерильной, так как посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды.
4. Плотная среда должна быть влажной и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию.
5. Обладать определённым окислительно-восстановительным потенциалом, то есть соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2.
6. Быть по возможности унифицированной, то есть содержать постоянное количество отдельных ингредиентов.
7. Быть прозрачной, так как в прозрачном растворе легче заметить загрязнение другими микроорганизмами
8. Иметь определенный рН

По агрегатному состоянию питательные среды делятся на жидкие, полужидкие и плотные. Жидкие среды представляют собой раствор питательных веществ в воде, в то время как в плотные и полужидкие добавляется загуститель. В качестве загустителя обычно используется желатин или агар-агар. Работать с плотными питательными средами можно, когда они находятся в расплавленном состоянии. Агар плавится при 85-95 °C, а застывает при 35-40 °C. Желатин же плавится при 32-35 °C, а застывает при 30°C. Таким образом, у агара более широкий диапазон температур, при котором с ним можно работать, поэтому он намного чаще используется в микробиологии. По составу питательные среды делятся на натуральные, полусинтетические и синтетические. Натуральные среды готовят из продуктов животного и растительного происхождения (мясо, асцит, костная мука, кормовые дрожжи, сгустки крови и др.). Полусинтетические среды – это среды, главными компонентами которых являются соединения известного химического состава — углеводы, соли аммония, фосфаты и т.д., а натуральные природные компоненты содержатся в небольших количествах. Это может быть дрожжевой автолизат, почвенный экстракт или гидролизаты молока, казеина и т.п. Синтетические среды готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дистиллированной воде. Для синтетических питательных сред точно известен состав, в то время как у натуральных и полусинтетических сред состав не полностью определен. По консистенции питательные среды делятся на жидкие, сыпучие и твердые. Основу сыпучих сред составляют зерно, жмыхи, разваренное пшено, отруби и другие подобные вещества. Применяют их главным образом в промышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологически активных соединений, а также в коллекциях для сохранения культур микроорганизмов. По применению питательные среды делятся на основные, специальные, транспортные, элективные и дифференциально-диагностические. Основные среды служат для культивирования большинства микроорганизмов, специальные – только для культивирования отдельных микроорганизмов, которые не растут на основных питательных средах. Транспортные среды используют для транспортировки микроорганизмов в коллекции или другие лаборатории. Они могут отличаться по составу от сред, на которых те же самые микроорганизмы культивируются в обычных условиях. Например, в лаборатории бактерий культивируют на жидкой среде, а транспортируют на твердой. Элективные среды используют для получения накопительной культуры микроорганизмов. Это тип сред, в которых создаются условия для развития определенной физиологической группы микробов. Например, после кипячения уничтожаются все неспорообразующие бактерии, в присутствии кислорода не растут анаэробы, а при низких значениях рН развиваются только ацидофилы. Дифференциально-диагностические среды позволяют отличить один вид микробов от другого по ферментативной активности. Дифференциально-диагностические среды особенно широко применяются в санитарной и медицинской микробиологии для быстрой идентификации определенных групп микроорганизмов. Методы стерилизации Стерилизация– полное освобождение какого-либо вещества или предмета от микроорганизмов путем воздействия на них физическими или химическими факторами. Все используемые для посева питательные среды, инструменты и посуда должны быть стерильны, чтобы не загрязнить исследуемый биоматериал посторонними бактериями. Существуют следующие методы стерилизации:

• термические (паровой, воздушный, глассперленовый);
• химические (газовый, растворы химических соединений);
• радиационный;
• плазменный и озоновый (группа хим. средств);
• метод мембранных фильтров: применяется для получения небольшого количества стерильных растворов, качество которых может резко ухудшиться при действии других методов стерилизации.

Паровая стерилизация осуществляется подачей насыщенного водяного пара под давлением в паровых стерилизаторах (автоклавах). Такая методика считается наиболее эффективным методом, так как чем выше давление, тем выше температура пара, стерилизующего материал. Паровой стерилизации подвергают изделия из текстиля (бельё, вату, бинты, шовный материал), из резины, стекла, некоторых полимерных материалов, питательные среды, лекарственные препараты. В настоящее время паровая стерилизация продолжает оставаться самым распространенным в мире способом стерилизации. Данный метод высокоэффективен, экономичен и приемлем для многих медицинских изделий. Для газовой (холодной) стерилизации используют герметичные контейнеры или специальные аппараты с камерами, заполняемыми парами окиси этилена, формальдегида или специализированными многокомпонентными системами. Используются при обработке приборов, аппаратов, сложных оптических систем, крупногабаритных изделий или изделий из титана, полимерных смол, резин. Для химической стерилизации растворами применяются основных четыре группы веществ:

• Кислота+окислитель (например, «Первомур»)
• Альдегид (например, формалин)
• Детергент (например, хлоргексидина биглюконат)
• Галоид (например, Повидон-йод)

Концентрация стерилизанта и время экспозиции зависит от используемого химического вещества. Наиболее широко в мире применяется стерилизация с помощью этиленоксида. Этиленоксидная стерилизация прекрасно зарекомендовала себя в большинстве стран мира, оборудование для ее проведения выпускается большим количеством производителей в различных странах Европы и Америки. Этиленоксидный метод обеспечивает самый щадящий температурный режим стерилизации. Формальдегид нашел широкое применение в качестве стерилизанта высокого уровня с использованием специальных камер. Для стерилизации же он не является самым удачным выбором. Низкая проникающая способность формальдегида приводит к тому, что данный метод требует применения рабочей температуры в пределах 65 – 80°С, и многие специалисты вообще не считают этот метод низкотемпературным. Для формальдегида имеются существенные ограничения в отношении стерилизации полых изделий, изделий с отверстиями и каналами. Весьма существенно, что для формальдегида не разработано нейтрализаторов и полного мониторинга процесса стерилизации. Химические методы стерилизации показали себя надежными и эффективными методами. Однако и они не лишены определенных недостатков. В первую очередь, к ним следует отнести высокую токсичность используемых стерилизантов, что требует выполнения очистки стерилизуемого оборудования и материалов от остатков стерилизационного агента, сохраняющихся на поверхности и в порах материала после цикла стерилизации. Также необходимо учесть тот факт, что не все материалы, используемые для производства медицинских изделий, выдерживают химическое воздействие стерилизантов. Радиационный метод (лучевую стерилизацию γ-лучами) применяют в специальных установках при промышленной стерилизации однократного применения — полимерных шприцев, систем переливания крови, чашек Петри, пипеток и других хрупких и термолабильных изделий. Некоторое время в фармтехнологии для стерилизации используется ультрафиолетовое (УФ) (длина волны 253,7 нм). Источником УФ-излучения являются ртутные кварцевые лампы. Их мощное бактериостатическое действие основано на совпадении спектра испускания лампы и спектра поглощения ДНК микроорганизмов, что является причиной их гибели при длительной обработке излучением кварцевых ламп. При недостаточно мощном действии УФ в клетках микроорганизмов активизируются процессы репарации и клетка может восстановиться. Метод применяется для стерилизации воздуха приточно-вытяжной вентиляции, оборудования в биксах, также для стерилизации дистиллированной воды. Радиационная стерилизация – эффективный метод стерилизации, подходящий для многих инструментов, имплантатов и материалов. Его промышленное применения для стерилизации одноразовых медицинских инструментов и материалов является наиболее оправданным. Однако, подобные установки не используются в отделениях стерилизации ЛПУ, следовательно, не могут обеспечивать рутинную обработку многоразовых инструментов и материалов. Метод плазменной стерилизации основан на действии плазмы перекиси водорода (Н₂О₂). Она состоит из ионов, электронов, нейтральных атомов и молекул и образуется под действием внешних источников энергии, таких как температура, радиационное излучение, электрическое поле и др. При этом методе после впрыскивания раствора перекиси водорода в стерилизационную камеру включается источник электромагнитного излучения, под воздействием которого одновременно происходит деление одной части молекул Н₂О₂ на две группы (ОН^—), а другой части — на одну гидропероксильную группу (ООН^—) и один атом водорода, сопровождающееся выделением видимого и ультрафиолетового излучения. В результате создается биоцидная среда, состоящая из молекул перекиси водорода, свободных радикалов и ультрафиолетового излучения. При отключении электромагнитного поля свободные радикалы преобразуются в молекулы воды и кислорода, не оставляя никаких токсичных отходов. Плазменная стерилизация является единственным экономически эффективным методом стерилизации медицинских изделий из материалов, чувствительных к действию высокой температуры и влаги, а также инструментов и изделий, содержащих узкие, с трудом поддающиеся стерилизации каналы, которые могут стать входными воротами для инфицирования больного в стационаре. В плазменном стерилизаторе допускается обрабатывать практически всю номенклатуру применяемых в ЛПУ медицинских изделий. К ним относятся изделия из полимеров, электроинструменты и кабели, оптоволоконные световодные системы, электронные устройства, электрофизиологические катетеры, изделия из оптического стекла, металлические инструменты для микрохирургии и многое другое. Посев микроорганизмов из почвы. В почве обитает огромное количество микроорганизмов, и если сразу высеять почву на питательную среду, получится сплошной бактериальный газон, где невозможно будет подсчитать количество колоний. Поэтому перед посевом готовят ряд разведений.

1. Взвешивают 1 г почвы
2. Готовят первое разведение. Стерильно в пламени спиртовки помещают навеску в колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды. Получается разведение в 100 раз.
3. Готовят второе разведение. Тщательно перемешивают содержимое колбы, отбирают пипеткой 1 мл раствора и переносят во вторую колбу, содержащую 99 мл стерильной водопроводной воды. Получается разведение в 10000 раз.
4. В чашку Петри стерильно наливают расплавленную стерильную питательную среду. Предварительно проверяют температуру среды: если терпит щека, то на такую среду можно высевать бактерий.
5. Тщательно перемешивают содержимое колбы со вторым разведением. Стерильно пипеткой отбирают 1 мл жидкости и переносят его в чашку Петри. Перемешивают со средой, не отрывая чашку Петри от поверхности стола.

Посев микроорганизмов из водопроводной воды.

1. Прокаляют кран в пламени спиртовки.
2. Открывают кран и в течение 10 минут спускают воду, чтобы смыть микробов, скопившихся в трубах.
3. Отбирают воду в стерильную пробирку.
4. В чашку Петри стерильно помещают расплавленную питательную среду и вносят пипеткой 1 мл отобранной водопроводной воды.

Посев микроорганизмов из стоячей воды.

1. Готовят первое разведение. Отбирают пипеткой 1 мл стоячей воды и стерильно переносят ее в пробирку, содержащую 9 мл стерильной водопроводной воды. Получают разведение в 10 раз.
2. Готовят второе разведение. Стерильно пипеткой отбирают 1 мл воды из пробирки с первым разведением и переносят ее во вторую пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Получают разведение в 100 раз.
3. В чашку Петри стерильно помещают расплавленную питательную среду и вносят пипеткой 1 мл воды из второго разведения.

Посев микроорганизмов из воздуха.

1. В чашку Петри стерильно помещают расплавленную питательную среду.
2. Открывают чашку Петри и оставляют на 5 мин в помещении вдали с закрытыми окнами и дверями, чтобы отсутствовало движение воздуха.
3. Через 5 мин закрывают чашку Петри.

Задание.

1. Осуществить посев микроорганизмов из водопроводной воды
2. Осуществить посев микроорганизмов из стоячей воды
3. Осуществить посев микрооганизмов из почвы
4. Осуществить посев микроорганизмов из воздуха.