Лабораторная работа № 4

  КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ   Цель занятия. Знать типы питательных сред и ингредиенты, используемые для их приготовления; устройство термостата, анаэростата, эксикатора и их назначение; условия и методы культивирования микроорганизмов. Знать технику посева микроорганизмов на питательные среды и методы определения численности их в различных субстратах. Уметь готовить основные питательные среды. Уметь делать посевы микроорганизмов на плотные питательные среды (МПА) Материалы и оборудование. Образцы готовых питательных сред фабричного производства; компоненты питательных сред: агар-агар, желатина, пептон. Термостат, эксикатор, анаэростат (для демонстрации). Стерильные пробирки, чашки Петри, пипетки на 1 мл и 10 мл, расплавленный МПА, разлитый в пробирки на 15 мл, электроплитка, водяная баня, восковые карандаши, стерильная вода, водопроводная вода  

1.  Классификация питательных сред и способы их приготовления

  Питательные среды классифицируют в зависимости от исходных компонентов, консистенции, целевого назначения, химического состава.   В зависимости от  х и м и ч е с к о г о  с о с т а в а  и  и с х о д н ы х   к о м п о н е н т о в различают следующие типы питательных сред. Среды неопределенного химического состава. Их подразделяют на: 1) среды животного происхождения (исходные продукты — мясо, рыба, яйца, молоко и т. д.); 2) среды растительного происхождения (исходные продукты — соя, горох, картофель, морковь и т. д.). Некоторые продукты используют в натуральном виде – естественные среды (картофель, морковь, молоко и т.д.), но чаще животные и  растительные ткани подвергают различной обработке (экстрагированию, ферментативному или кислотному гидролизу) – искусственные среды. Среды известного химического состава (синтетические). В них входят известные химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и т. д.) в оптимальном количественном соотношении. Синтетические питательные среды используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных сред, например при получении диагностических аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизма в том или ином конкретном химическом соединении. По   к о н с и с т е н ц и и  питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие. Жидкие    питательные    среды.     Готовят,    используя    экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов; Полужидкие    и    плотные    питательные   среды.    Необходимую консистенцию среде придают добавлением различных уплотнителей. А г а р — а г а р (малайское желе) — полисахарид, продукт переработки некоторых морских водорослей. Плавится при 80 — 86°С, затвердевает при 40°С. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5 — 2%, реже 3%; полужидких — 0,3 — 0,7 %. Ж е л а т и н а — экстракт из тканей, содержащих много коллагена (кости, хрящи, сухожилия и т.д.). Желатиновый гель плавится при 25°С, что делает его неудобным для выращивания микроорганизмов с температурным оптимумом 37 — 38°С. Кроме того, ряд бактерий выделяет протеолитические ферменты, разлагающие желатину. Обычно в питательные среды вносят 10 — 20% желатины. По ц е л е в о м у н а з н а ч е н и ю различают общеупотребительные (обычные), обогащенные, специальные, элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические питательные среды. Общеупотребительные   (обычные)    среды.    Их    применяют    для культивирования относительно неприхотливых микроорганизмов. В качестве исходных компонентов для приготовления обычных сред используют наиболее часто мясную воду, растительные гидролизаты. М я с н а я   в о д а: говядину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. Мясной фарш заливают водопроводной водой   в соотношении 1:2, кипятят 1 ч. После кипячения мясную воду охлаждают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по емкостям, закрывают ватно- марлевыми пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин. М я с о – п е п т о н н ы й б у л ь о н (МПБ). К 1 л мясной воды добавляют 1% пептона (пептон — промежуточный продукт распада белков, состоящий из полипептидов и аминокислот; готовят из сычугов крупного рогатого скота и желудков свиней; выпускают в виде порошка, хорошо растворимого в воде) и 0,5% хлорида натрия, устанавливают необходимую рН дробным добавлением 10%-го раствора гидроксида натрия или гидроксида калия. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют при 120°С 15 — 20 мин. М я с о – п е п т о н н ы й а г а р (МПА). К МПБ добавляют 2 — 3% агар-агара, доводят до кипения, в горячем виде проверяют рН, затем, если необходимо, доводят его до нужного значения (7,2 — 7,6), фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Профильтрованный горячий агар разливают по пробиркам и колбам, стерилизуют автоклавированием при 1 атм 20 — 30 мин. М я с о – п е п т о н н а я ж е л а т и н а (МПЖ). К МПБ добавляют 10 — 20% измельченной желатины, нагревают до расплавления уплотнителя, устанавливают рН 7,2 — 7,4, кипятят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют дробно в аппарате Коха три дня по 20 мин или однократно в автоклаве при 112°С 15 мин. Предприятия биологической промышленности выпускают готовые питательные бульон и агар в виде сухого порошка. Способ приготовления указывается на этикете. Обогащенные среды. Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на общеупотребительных питательных средах, по — этому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т.д. Такие питательные среды получили название обогащенных. С ы в о р о т о ч н ы й и к р о в я н о й а г а р ы: к расплавленному и охлажденному до 45 — 50°С стерильному питательному агару добавляют 5 — 10% стерильной дефибринированной крови барана (кролика) или сыворотки крови (лошади, крупного рогатого скота, кролика). Для получения дефибринированной крови у барана кровь берут асептично из яремной вены стерильной иглой в стерильный флакон (или колбочку) со стеклянными (фарфоровыми) бусами или шариками, встряхивают вращательными движениями 15 — 20мин, чтобы предотвратить свертывание крови. Фибрин остается на бусах. Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри, пробирки и оставляют до застывания питательной среды. С ы в о р о т о ч н ы й и к р о в я н о й  б у л ь о н ы  готовят  аналогичным образом. Растворы углеводов (глюкоза и др.) стерилизуют текучим паром или фильтрованием и добавляют в количестве 0,5 — 1% к питательной среде.   Специальные среды. Так называют среды, разработанные с учетом специфических ростовых потребностей ряда бактерий. Например, желточная среда Мак-Коя для возбудителя туляремии, среда Терских для культивирования лептоспир и др. С р е д а М а к – К о я: чистые куриные яйца обрабатывают спиртом, быстро проводят через пламя горелки. Стерильно вскрывают, желтки отделяют от белков. К 60 частям желтков добавляют 40 частей физиологического раствора (рН 7,0 — 7,2). Компоненты перемешивают, разливают в пробирки по 4 — 5 мл и помещают в наклонном положении в аппарат для свертывания сыворотки. Стерилизуют в первый день при 75°С 1ч, на второй день при 85°С 30 мин. Для контроля стерильности приготовленные среды выдерживают 2 суток в термостате при 37 — 38°С. С р е д а Т е р с к и х состоит из фосфатной смеси Зеренсена  и кроличьей сыворотки. Смесь Зеренсена: раствор А: гидрофосфат натрия — 11,876 г, вода дистиллированная -1000 мл; раствор Б: дигидрофосфат калия — 9,078 г, вода дистиллированная — 1000 мл. К 90 мл раствора А добавляют 10 мл раствора Б и доводят объем дистиллированной водой до 1000 мл. Раствор разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют при 1,5 атм. 20 мин. В каждую пробирку добавляют шесть — восемь капель стерильной инактивированной при 56 °С сыворотки кролика. Элективные среды (лат. electus — избранный). Это питательные среды для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида или группы родственных из материалов, содержащих несколько видов микробов. Элективные среды чрезвычайно многообразны по своему составу. В них включают компоненты, обеспечивающие преимущественный рост искомого микроорганизма и (или) подавляющие в той или иной степени рост сопутствующей микрофлоры. По консистенции среды данного типа могут быть плотными и жидкими. Жидкие элективные среды называют средами обогащения или накопления, их применяют, когда ставят цель увеличить количество искомого микроорганизма в смешанной популяции. С р е д а Ш у с т о в о й предназначена для выделения сальмонелл. Представляет собой МПА (рН 7,4) с добавлением 10% к объему среды 50% водного раствора тиосульфата натрия и 2 % раствора Люголя. С р е д а М ю л л е р а предназначена для культивирования сальмонелл. В колбу с 4,5 г стерильного мела наливают 90мл МПБ, стерилизуют в автоклаве при 120°С 30 мин. Затем стерильно добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора тиосульфата натрия (тиосульфат натрия — 50 г, дистиллированная вода — 100мл), стерилизуют в аппарате Коха 30 мин. С р е д а В и н о г р а д с д с к о г о предназначена для выделения из среды обитания (из почвы) микроорганизмов –  нитрификаторов, окисляющих аммиак до нитратов. Дифференциально-диагностические среды. Предназначены для определения родовых или видовых особенностей исследуемых культур   микробов (гемолитических, протеолитических, редуцирующих и др. свойств), выявления ферментов у микроорганизмов. По консистенции могут быть жидкими, полужидкими, плотными. В состав этих сред входят обычная питательная среда, обеспечивающая рост изучаемого микроорганизма, субстрат для обнаружения фермента и индикатор, по изменению цвета которого судят о сдвиге рН среды в результате расщепления субстрата. К питательным средам такого типа относят среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина и др. С р е д ы Г и с с а используют для изучения гликолитических  ферментов, выделенных культур микроорганизмов. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1% пептона, 0,5 г хлорида натрия. Компоненты растворяют, фильтруют через бумажный фильтр,  устанавливают рН 7,0 — 7,4, добавляют один из углеводов-субстратов (лактоза, глюкоза и т.д.), агар-агар (0,3 — 0,4%), а затем 1мл индикатора Андрэдэ или 0,1мл 1,6% раствора бромтимолового синего. Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки, стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 мин или при 112°С 20 мин. Выпускают сухие среды Гисса с индикатором ВР — смесь водно-голубого с розоловой кислотой (готовые среды — полужидкой консистенции). Плотные дифференциально-диагностические среды применяют для первичной изоляции возбудителей из материала. В их состав нередко, кроме известного субстрата, входят вещества, придающие питательной среде селективные свойства. С р е д а Э н д о содержит лактозу в качестве субстрата и предназначена для дифференциации бактерий, различающихся по способности расщеплять лактозу. К 1000мл расплавленного МПА (рН 7,4) температурой 70°С добавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в небольшом количестве дистиллированной кипяченой воды. В отдельных пробирках готовят: 2 — 3мл спиртового раствора основного фуксина; 10 мл 10% водного раствора сульфата натрия. В стерильную пробирку вносят 1 мл раствора фуксина и добавляют раствор сульфита натрия до обесцвечивания фуксина. Приготовленную смесь вливают в расплавленный агар, перемешивают и разливают по чашкам Петри. Готовая среда бесцветна, при росте на ней микроорганизмов, расщепляющих лактозу, среда закисляется, обесцвеченный фуксин восстанавливается, и колония микроорганизма, например эшерихий, приобретает красный цвет с металлическим оттенком. Среду готовят за сутки до ее использования. Выпускают также сухую среду Эндо. Перед употреблением определенную навеску порошка вносят в дистиллированную воду, кипятят и разливают по чашкам Петри. С р е д а Л е в и н а аналогична по целевому назначению среде Эндо, но содержит другой индикатор (эозин с метиленовым синим). К 100 мл расплавленного МПА (рН 7,2 — 7,4) добавляют 2 мл 0,5% водного раствора   метиленового синего, 1,5 мл 2% раствора эозина желтого, 2 г лактозы, 0,2 г дигидрофосфата калия. Растворы красителей готовят на дистиллированной воде, стерилизуют текучим паром 60 мин. Лактозу и дигидрофосфат калия предварительно разводят в небольшом количестве стерильной дистиллированной воды и кипятят. Колонии лактозопозитивных бактерий на этой среде окрашены в фиолетово-черный цвет. А г а р П л о с к и р е в а предназначен для выделения сальмонелл, содержит лактозу в качестве субстрата и компоненты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. Среду выпускают в виде порошка, в ее состав кроме питательной агаровой основы входят: желчные соли, цитрат натрия, тиосульфат натрия, фосфат натрия, бриллиантовый зеленый, кальцинированная сода, йод, хлорид натрия, лактоза, нейтральный красный. Навеску порошка растворяют в воде, кипятят и разливают в чашки Петри. Готовая среда прозрачная или розовая. Колонии сальмонелл бесцветные, эшерихий – брусничные.  

2.  Посев на питательные среды микроорганизмов воды, почвы, воздуха

 

• Условия и методы культивирования микроорганизмов

Микроорганизмы, выращенные в лабораторных условия называют микробными культурами, а получение их роста на питательных средах называют культивированием. Для культивирования необходимы следующие основные условия: оптимальный температурный режим с учетом, к какой группе относится исследуемый вид микробов (мезофилы, термофилы, психрофилы), соответствующие питательные среды, аэробиоз (или анаэробиоз).

1. Для обеспечения постоянной оптимальной температуры требуемого уровня служат термостаты. Лабораторный термостат представляет собой шкаф с двойными стенками, снаружи облицованный материалом — непроводником тепла (пластик, дерево), внутренняя стенка металлическая. Между двумя металлическими стенками находится вода (или воздух), подогреваемая электронагревателями. Постоянная температура в термостатах поддерживается при помощи различных типов терморегуляторов.
2. Помимо обеспечения температурного режима, следует учитывать тип дыхания микроорганизмов: при аэробном типе дыхания никаких дополнительных условий создавать не нужно. Для анаэробов необходимо исключить доступ свободного кислорода воздуха. С этой целью используют эксикатор или анаэростат.

Э к с и к а т о р представляет собой стеклянный сосуд с притертой крышкой. Создание анаэробиоза можно осуществить физическим, химическим и биологическим методами. Физический метод состоит в том, что из герметично закрытого эксикатора выкачивают воздух.   Для обеспечения анаэробиоза химическим способом на дно эксикатора ставят чашку Петри с химическими веществами, которые активно связывают кислород воздуха (например, смесь гидросульфита натрия и углекислой соды). Биологический метод создания анаэробиоза основан на совместном выращивании аэробов и анаэробов. А н а э р о с т а т – металлический или пластиковый, герметически закрывающийся сосуд, снабженный кранами для удаления воздуха, служит также для создания анаэробиоза. В настоящее время для культивирования облигатно-анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов используются газогенераторные пакеты (CampyPakPlus). К любым питательным средам, применяемым для культивирования микроорганизмов, предъявляют ряд основных требований: 1) стерильность и по возможности прозрачность; 2) содержание необходимых для жизнедеятельности клеток биохимических факторов – источников энергии, углерода, азота, серы, а также неорганических ионов – обязательно в форме, доступной для усвоения микроорганизмами; 3) оптимальные значения ряда биофизических показателей: концентрации водородных ионов (рН), окислительно-восстановительного потенциала (Eh), активности воды (a_w), осмотического давления.  

2.2.    Техника посева микроорганизмов на плотные питательные среды

Для определения численности микроорганизмов в различных субстратах (почве, воде, жидкостях и т. п.) применяется метод питательных пластин (метод Коха) либо метод прямого счета микроорганизмов на препаратах или в специальных счетных камерах. Сущность метода питательных пластин заключается в нанесении исследуемого субстрата на поверхность твердой питательной среды.  

Ход работы

1) Почва. Методом последовательного разведения готовят почвенные суспензии, содержащие различные концентрации почвы в 1 мл. Для этого берут 4 — 5 пробирок, нумеруют их. Стерильной пипеткой в каждую пробирку вносят по 9 мл стерильной воды. Навеску почвы в 1 г, соблюдая условия асептики, переносят в колбу с 99 мл стерильной воды (получают первое разведение 1/100). Смесь взбалтывают 5 минут, не смачивая пробку, дают отстояться 30 сек — 1,5 мин и далее стерильной пипеткой переносят 1 мл почвенной суспензии из колбы в пробирку № 1 с 9 мл воды, получают второе разведение 1/1000. Подобным образом готовят ряд последующих разведений почвенной суспензии 1/10000, 1/100000, 1/1000000 и более. Посев. Берут 1 мл суспензии определенного разведения и переносят в стерильную чашку Петри. Затем в них вливают расплавленные МПА, заранее   приготовленный и разлитый в пробирки (2/3 объема) из расчета одна пробирка на чашку. Температура arapa должна быть примерно 45 — 50°С. Осторожным круговым движением чашки, не смачивая крышку, агар перемешивают с суспензией. Чашки с застывшим агаром переворачивают вверх дном, чтобы избежать попадания на поверхность агара конденсационной воды с крышки. На чашках восковым карандашом отмечают почву, разведение, номер группы и помещают их в термостат при 28 — 30°С на 5 — 7 дней.  

• Вода. Определение количества микроорганизмов в воде осуществляют, пользуясь методом питательных пластин. Сначала стерильной пипеткой берут 1 мл водопроводной воды (или из открытого водоема) и вносят в колбу с 99 мл стерильной воды, хорошо перемешивают. Затем методам разведения готовят разные концентрации жидкости, делают посев (см. предыдущую работу – посев почвы).

 

• Воздух. Для определения количества микробов в воздухе наиболее простым, но недостаточно точным является метод Коха (осаждение клеток микроорганизмов на плотных питательных средах).

Посев. Стерильные чашки Петри с питательной средой (МПА) открывают в исследуемом помещении на 5 мин (частицы пыли с микробами под действием силы тяжести оседают на поверхность плотной среды, образуют на ней колонии, и их можно подсчитать). Чашку закрывают, переворачивают вниз крышкой, восковым карандашом делают соответствующие надписи (номер аудитории, где проводятся исследования, или других помещений, номер учебной группы) и чашку помещают в термостат при 28 — 30°С на 5 -7 суток.  

Контрольные вопросы

1. Какие общие требования предъявляют к питательным средам?
2. На какие группы классифицируют питательные среды?
3. Как культивируют аэробные и анаэробные микроорганизмы?
4. Какие методы можно использовать при культивировании микроорганизмов из почвы, воды, воздуха?