Эксперт по сдаче вступительных испытаний в ВУЗах
Лабораторное занятие 8. Идентификация бактерий – определение бактерий до рода. Окраска по Граму
Идентификация бактерий – определение бактерий до рода. Окраска по Граму
Цели занятия:
- Изучить морфологические свойства культуры бактерий;
- Проверить характер роста на средах Гисса, РПА и КПА;
- Провести окраску по Граму;
- Провести реакцию на обнаружение каталазы;
- Сделать вывод о родовой принадлежности исследуемой бактерии.
Материалы и оборудование: пробирки с бактериями с прошлого занятия, штативы, микроскопы, предметные стекла, покровные стекла, спиртовки, спирт, микробиологические петли, промывалки с водой, маркеры, гемцианвиолет, раствор Люголя, фуксин, ванночки с мостиками, пероксид водорода.
В настоящее время для идентификации бактерий используется полифазный анализ – проверка морфологических, культуральных, тинкториальных, биохимических и молекулярно-генетических свойств. Часто для идентификации бактерий до рода бывает достаточно проверить только некоторые свойства из этого списка.
Морфологические свойства
Для изучения морфологии клеток используют световой микроскоп. Проверяют форму клеток (кокки, палочки, извитые), подвижность, наличие или отсутствие спор.
Культуральные свойства
Для проверки культуральных свойств бактерии культивируют на различных стандартных средах.
Рост на средах Гисса
Среды Гисса («пестрый ряд») — это дифференциально — диагностические среды, используемые для выявления сахаролитической активности бактерий. В состав среды входит какой-либо углевод (сахароза, мальтоза, галактоза…) и индикатор рН. Если на среде Гисса наблюдается рост, значит бактерии могут использовать входящий в ее состав углевод в качестве источника углерода. Если происходит подкисление среды и изменяется цвет индикатора, значит углевод утилизируется за счет брожения. Если же при росте бактерий цвет среды не изменяется, значит углевод утилизируется за счет дыхания.
Рост на столбике РПА
По характеру роста бактерий после посева уколом на столбик РПА судят об их отношении к кислороду. Если рост наблюдается на дне пробирки, то исследуемые бактерии – анаэробы, если по всему уколу – факультативные анаэробы, если на поверхности столбика – аэробы.
Рост на КПА (крахмало-пептонный агар)
Применяется для выявления способности испытуемого микроорганизма синтезировать амилазу для использования крахмала как источника углерода и энергии. На скошенный агар с добавлением 1% пептона и 1-2% крахмала засевают штрихом исследуемую культуру. Просветление среды вокруг микробных колоний, свидетельствует о гидролизе крахмала. Для получения более четко выраженных результатов реакции пользуются раствором Люголя. При добавлении нескольких миллилитров этого раствора фон среды окрашивается в синий цвет, кроме зон, в которых произошел гидролиз крахмала. При полном гидролизе среда становится прозрачной, в зонах, где крахмал гидролизуется до декстрина, она приобретает красно-бурый цвет.
Тинкториальные свойства
Окраска по Граму
Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки. У грамположительных бактерий в составе клеточной стенки имеется мощный пептидогликановый слой (15-80 нм), в то время как у грамотрицательных бактерий толщина пептидогликанового слоя значительно меньше (2-8 нм). Суть окрашивания по Граму заключается в том, что фиксированный препарат окрашивается гемцианвиолетом, который затем вымывается спиртов. В случае грамположительных бактерий краситель связывается с толстым пептидогликановым слоем и клетки приобретают синий цвет. Тонкая стенка грамотрицательных бактерий не может задержать краситель, и он вымывается спиртом. Поэтому клетки приобретают красный цвет.
К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии. Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.
Ход работы
- Приготовить мазок.
- Зафиксировать в пламени горелки.
- Нанести первый краситель – гемциан-виолет. Выдержать 4-5 мин.
- Не промывая мазок, нанести несколько капель раствора Люголя. Выдержать до 1 мин (препарат должен потемнеть, но не почернеть).
- Раствор Люголя слить.
- Препараты опустить в ванночку с 960этиловым спиртом на 45 сек.
- Препарат промыть до «чистой воды»
- Нанести второй краситель – фуксин – на 1-2 мин.
- Препараты промыть и подсушить.
- Грамположительные бактерии – сине-фиолетовая окраска (1-й краситель). Грамотрицательные бактерии – красно-розовая окраска (2-й краситель).
Существуют различные модификации дифференциального метода окраски клеточных стенок бактерий. Их целью является «более точная идентификация» типа клеточной стенки в специальных случаях (например, для отдельных видов микроорганизмов). Чаще всего вместо фуксина в качестве второго красителя используют сафранин, при этом клетки грамотрицательных бактерий окрашиваются в оранжево-розовый цвет, что позволяет четче их различить.
Биохимичесикие свойства
Обнаружение каталазы. На предметное стекло наносят каплю 1—3 % раствора пероксида водорода и вносят в нее петлю с бактериальной культурой. Каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Выделение пузырьков газа свидетельствует о наличии у данного вида бактерий каталазы.
Определение бактерий
- Грамположительные микро- или диплококки – семейсто Streptococcaceae.
- Грамположительные тетракокки – семейсто Micrococcaceae.
- Грамотрицательные палочки без спор – род Pseudomonas.
- Грамположительные палочки без спор – семейство Lactobacillaceae.
- Грамположительные палочки со спорами – семейство Bacillaceae.
Задание.
- Микроскопировать выросшие бактерии.
- Оценить рост бактерий на средах Гисса, РПА и КПА.
- Провести реакцию на каталазу.
- Провести окрашивание по Граму.
- Заполнить таблицу.
Таблица 2. Характеристика бактериальной культуры
| Рост бактерий на средах |
Морфология клеток |
Наличие спор |
каталаза |
Окраска по Грама |
| Среда Гисса с мальтозой |
Среда Гисса с сахарозой |
РПА |
КПА |
| |
|
|
|
|
|
|
|
6. Сделать вывод о родовой принадлежности бактерий.
Ссылка на первоисточник:
http://omsk-osma.ru
