Лабораторная работа № 2

  ПРИГОТОВЛЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ И МЕТОДЫ ИХ ОКРАСКИ   Цель занятия. Знать технику приготовления препаратов для световой микроскопии. Уметь готовить живые препараты микроорганизмов и фиксированный препарат-мазок. Научиться окрашивать препараты простым и дифференцированными методами. Материалы и оборудование. Набор готовых растворов красок: фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий и другие; культуры микроорганизмов, предметные и покровные стекла, бактериологические петли, фильтровальная бумага, микроскопы, спирт, спиртовые горелки, вазелиновое масло, пинцет, дистиллированная вода, карандаш по стеклу, часы, сливные чашки с «мостиками».  

1.  Методы приготовления препаратов для микроскопирования

  Препараты для микроскопии готовят на предметном стекле. Материалом служат взвеси микробных культур, выросших на питательных средах (жидких и плотных), молоко и др. В зависимости от характера объекта и цели исследования выбирают тот или иной метод приготовления препарата для микроскопии. При микроскопии живых микроорганизмов пользуются методами «висячей» и «раздавленной» капли.  

Ход работы

• Метод «раздавленной» капли

На предметное стекло пипеткой или микробиологической петлей наносят каплю культуры микробов. Покровное стекло ставят на ребро у края капли и постепенно опускают на нее. При осторожном опускании покровного стекла между стеклами не остается пузырьков воздуха, мешающих микроскопированию. Капля должна быть небольшой, чтобы после «раздавливания» жидкость не выступала за края покровного стекла. Препарат из-за высыхания не может долго храниться.  

1.2.  Метод «висячей» капли

Каплю культуры микроорганизмов наносят петлей или пипеткой в центр покровного стекла, после чего накладывают его каплей вниз на предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Капля не должна касаться краев лунки. Препарат может храниться долго. Микроскопирование живых препаратов («висячая» или «раздавленная» капли) производят с сухой (´40) или иммерсионной системой при несколько затемненном поле зрения (немного прикрыть диафрагму и опустить конденсор).  

1.3.  Приготовление препарата – мазка

Препарат-мазок готовят в несколько этапов:

1. Обезжиривают предметное стекло спиртом. Для этого на поверхность предметного стекла наносят несколько капель спирта, а затем протирают ее сухой салфеткой.
2. Стерилизуют бактериологическую петлю прокаливанием в пламени горелки, держа вертикально.
3. Пробирку со взвесью микробов держат в левой руке, в правой бактериологическую петлю (как авторучку), осторожно около пламени открывают пробирку свободными пальцами правой руки (мизинцем и безымянным), петлей захватывают каплю материала, пробирку закрывают, ставят в штатив. Свободной левой рукой берут предметное стекло за «ребра», наносят на его поверхность каплю и легкими круговыми движениями распределяют на стекле по площади размером 2 см².

Для приготовления мазка из микробной культуры, выросшей на плотной среде, на предметное стекло петлей наносят каплю стерильного физиологического раствора, затем, прокалив петлю и остудив ее, берут петлей с поверхности среды очень небольшое количество (едва прикоснувшись) микробной массы, аккуратно равномерно растирают ее в капле физраствора на предметном стекле тонким слоем.

4. Обводят границу мазка восковым карандашом с обратной стороны препарата.
5. Препарат высушивают на воздухе.
6. Фиксируют мазок — закрепляют на стекле (одновременно убивая бактерии). Фиксацию производят в пламени горелки, для чего медленно троекратно проводят препарат через пламя мазком кверху (фиксация на пламени не пригодна при изучении простейших, в этих случаях пользуются жидкими фиксаторами: например фиксаторами состоящими из равных частей эфира и этилового спирта, спирта и формалина и др.). После фиксации мазки окрашивают простым или сложными методами.

   

2.  Простой метод окраски

  При простом методе окраски используют только один какой — либо краситель.

Ход работы

На фиксированный препарат, помещенный на «мостике» над сливной чашкой, наливают раствор либо метиленового синего Леффлера (окрашивают 3 — 10 минут), либо фуксин Пфейффера (2 — 3 минуты) или генцианвиолет (1 — 2 минуты). Краску смывают водой, препарат высушивают фильтровальной бумагой. На готовый окрашенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют.  

3.  Дифференцированные методы окраски микробиологических препаратов

  Сложные методы окрашивания заключаются в том, что применяют несколько растворов красителей и реактивов. Они позволяют, помимо морфологии бактерий, определить их тинкториальные особенности (различное окрашивание при использовании специальных методов) и наличие (или отсутствие) структурных элементов клетки (капсула, спора), что имеет важное дифференциально-диагностическое значение.  

3.1.  Окраска по методу Грама

Это один из наиболее распространенных сложных методов окраски, основан на различиях в строении и химическом составе клеточной стенки. В зависимости от результатов окрашивания все бактерии подразделяют на г р а м п о л о ж и т е л ь н ы е и г р а м о т р и ц а т е л ь н ы е. При окрашивании генцианвиолет в присутствии йода (раствор Люголя) образует комплекс с компонентами клеточной стенки. У грамположительных прокариот клеточная стенка при обработке этиловым спиртом удерживает образовавшийся комплекс, и бактерии окрашены в фиолетовый цвет; у грамотрицательных этиловый спирт вымывает этот комплекс, и после дополнительного окрашивания препарата фуксином клетки приобретают розово-красный цвет. Примерами грамположительных микробов являются стафилококки, молочнокислые, нитрифицирующие микроорганизмы, возбудители сибирской язвы, рожи свиней и многие другие. Грамотрицательные микроорганизмы: кишечная палочка, возбудители сальмонеллеза, бруцеллеза, сапа, уксусные бактерии и др.  

Ход работы

1. На фиксированный препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги пропитанной спиртовым раствором генцианвиолета, сверху наносят несколько капель воды и окрашивают 2 — 3 минуты.
2. Не смывая водой, бумажку снимают и на мазок наносят раствор Люголя на 2 — 3 минуты,
3. Раствор Люголя   сливают,    не    промывая   водой,       препарат обрабатывают 96% спиртом 30 — 40 секунд, затем хорошо промывают водой.
4. Препарат дополнительно окрашивают раствором фуксина до 1 мин, вновь промывают водой, сушат фильтровальной бумагой и микроскопируют.

 

3.2.  Окраска по методу Ауески (спорообразующих микробов)

Спора – особая форма существования грамположительных бактерий, формируется эндогенно, характеризуется специфическими структурами (многослойные белковые покровы, наружная и внутренняя мембраны, кортекс) и повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам внешней среды.   Споры с большим трудом воспринимают красители, но прочно удерживают их после окраски. На этой особенности основаны все методы их выявления. Для окрашивания спор применяют красители с протравителями (карболовый фуксин Циля и др.) и подогревание, чтобы увеличить проницаемость оболочки. Для разрыхления оболочки перед окраской препараты обрабатывают кислотами.  

Ход работы

1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор соляной кислоты и подогревают на пламени в течение 2-3 минут.
2. Кислоту сливают,   препарат   промывают   водой,  просушивают   и фиксируют над пламенем.
3. На мазок наносят фуксин Циля через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 5-7 минут.
4. Снимают бумагу, промывают мазок водой.
5. На препарат наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 минуты для обесцвечивания.
6. Хорошо промывают водой.
7. Дополнительно окрашивают раствором метиленовой сини в течение 4

• 5 минут.

8. Промывают водой, сушат фильтровальной бумагой. Микроскопируют.

Споры окрашиваются в розово-красный цвет, вегетативные клетки — в синий.  

3.3.            Окраска по методу Циля-Нильсена (кислото-спирто- щелочеустойчивых микробов)

Микробы данной группы (микобактерии туберкулеза, паратуберкулезного энтерита крупного рогатого скота, проказы человека и др.) относятся к грамположительным, и для их дифференциации применяют специальные методы окрашивания, основанные на различной химической структуре цитоплазмы и клеточной оболочки. В их составе имеется значительное количество жировосковых веществ, в частности стеариновых кислот (в том числе фтионовой кислоты до 40 %), и микробы трудно воспринимают краски, но если они окрасились, то трудно обесцвечиваются кислотами, спиртами, щелочами.

Ход работы

1. На фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наносят раствор фуксина Циля, снизу препарат подогревают над пламенем горелки до появления паров и оставляют на «мостике» 5 -7 минут.
2. Снимают бумагу, промывают мазок водой.

 

3. На препарат наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 минуты для обесцвечивания.
4. Хорошо промывают водой.
5. Дополнительно окрашивают раствором метиленовой сини в течение 4

• 5 минут.

6. Промывают водой, сушат фильтровальной бумагой. Микроскопируют. Кислото-спирто-щелочеустойчивые микробы окрашиваются в красный цвет  (не          обесцвечиваются           кислотой),   некислотоустойчивые   —   в   синий (окрасившись     первоначально    фуксином     в     красный     цвет,     легко обесцвечиваются   кислотой  и   воспринимают   дополнительную   окраску

метиленовой сини).  

3.4.  Окраска по методу Бурри — Гинса (выявление капсул бактерий)

Капсула – это слизистое образование, обволакивающее клетку и сохраняющее связь с клеточной стенкой. У большинства прокариот капсула построена из полисахаридов гомо- и гетерополимерной природы. У некоторых видов бактерий капсула содержит полипептид – полимер D- глутаминовой кислоты. Вещество капсулы обычно воспринимает красители слабее, чем другие клеточные компоненты, поэтому при специальных методах окраски можно дифференцировать капсулу от других структур. Многие виды патогенных бактерий образуют капсулу, которая выполняет защитную функцию в основном за счет снижения  эффективности фагоцитоза.

Ход работы

1. Смешивают каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла со шлифовальным краем делают мазок таким же образом, как мазок из крови.
2. Мазок высушивают и фиксируют.
3. На мазок наносят водный раствор фуксина на 1- 2 минуты.
4. Промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, а неокрашенные капсулы контрастно выделяются на черно-розовом фоне.  

Контрольные вопросы

1. Какие существуют микробиологические препараты: какова методика их приготовления?
2. В чем их сущность простых и сложных методов окраски препаратов?
3. Окраска по   методу    Граму:   результат   окраски;   в    чем    сущность получаемого различного окрашивания?
4. В чем сущность методов окрашивания по выявлению у микроорганизмов — прокариот спор и капсул?