Лабораторная работа № 6

  УЧАСТИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В КРУГОВОРОТЕ УГЛЕРОДА И АЗОТА.   Цель занятий. Знать химизм, условия и значение спиртового, молочнокислого, маслянокислого брожения, разложения пектиновых веществ и клетчатки; морфологические и биохимические признаки микроорганизмов, вызывающих эти процессы. Уметь делать качественные реакции на конечные продукты данных брожений и микроскопировать возбудителей. Знать химизм, условия, возбудителей и значение процессов аммонификации, нитрификации и денитрификации. Знать механизм фиксации молекулярного азота микроорганизмами. Уметь различать морфологические особенности микроорганизмов, осуществляющих круговорот азота в природе; определять конечные продукты данных процессов. Уметь приготовить накопительную культуру свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов; выделить клубеньковые бактерии в чистую культуру.  

1.  Молочнокислое брожение

  Материалы и оборудование. Свежее молоко, колбы на 100 мл, пипетки на 5 и 10 мл, пробирки, микроскопы и все необходимое для приготовления препаратов; воронки, фильтры; 10% раствор AgNO₃; 13% раствор NH₄ОН; 10% Н₂SО₄; 5% раствор КМnO₄; насыщенный раствор СuSO₄; 0,2%   спиртовой   раствор  тиофена;   простокваша,  кефир,   рассол   капусты   или огурцов; водяная баня, электроплитка.   Молочнокислое брожение — это процесс разложения, углеводов молочнокислыми микроорганизмами с образованием преимущественно молочной кислоты. В зависимости от того, какие молочнокислые микробы вызывают это брожение и какие при этом образуются продукты, оно бывает трех типов: гомоферментативное, гетероферментативное и бифидоброжение. Гомоферментативное молочнокислое брожение, при котором из углеводов образуется только молочная кислота, вызывают следующие микроорганизмы: Streptococcus lactis (молочнокислый стрептококк) — овальные кокки величиной от 0,5 до 1 мкм, располагающиеся в культуре в виде диплококков или коротких цепочек, реже одиночными клетками, Г⁺, спор не образует. Streptococcus cremoris (сливочный стрептококк) отличается от молочнокислого стрептококка тем, что его клетки располагаются в виде длинных цепочек. Streptococcus thermophilus (термофильный стрептококк). Его клетки располагаются в виде цепочек различной длины. Он лучше развивается при повышенной температуре 40 — 45°С. Lactobacterium helveticum (сырная палочка) — неподвижная, грамположительная, длинная палочка (до 6 мкм), соединенная в длинные цепочки. Lactobacterium bulqaricum (болгарская палочка) — неподвижная, Г⁺, крупная палочка (4 — 5 мкм) с закругленными концами. Располагается в виде отдельных клеток и небольших цепочек. Lactobacterium acidophilus (ацидофильная палочка) — неподвижные, грамположительные палочки различной длины. Lactobacterium cucumeris (огуречная палочка) — короткие, Г⁺, неподвижные палочки, сцепленные парами или цепочкой. Огуречная палочка и близкая к ней Lactobacterium plantarum встречаются обычно в рассоле при квашении овощей и в силосе. Гетероферментативное молочнокислое брожение — наряду с молочной кислотой образуется значительное количество других продуктов, например, уксусная и янтарная кислоты, этиловый спирт, углекислый газ, ароматические вещества (диацетил, ацетоин, эфиры и др.), наиболее часто вызывают микроорганизмы: Streptococcus diacetilactis — ароматообразующие стрептококки придают молочнокислым продуктам приятный вкус и аромат, за счет образования летучих кислот и ароматических веществ. Клетки этих микробов мелкие и располагаются цепочкой разной длины. Lactobacterium brevis, Lactobacterium fermentum — мелкие палочковидные клетки (1,5 — 5 мкм). Сбраживают сахара с образованием молочной кислоты,   этилового спирта, углекислого газа и уксусной кислоты. Встречаются на растениях. Escherichia coli — мелкая, подвижная палочка, Г ^—, свертывает молоко с образованием углекислого газа. Бифидоброжение вызывают микроорганизмы рода Bifidibacterium. Они имеют вид прямых или разветвленных палочек встречаются раздвоенные V- формы, булавовидные или лопатовидные формы. Не образуют спор, Г⁺, неподвижные. Углеводы сбраживают главным образом до уксусной и молочной кислот. Типичный представитель рода Bifidibacterium bifidum. Бифидобактерии — обитатели кишечника человека, животных, насекомых и т. п., являются антагонистами гнилостной и болезнетворной кишечной микрофлоры. Молочнокислые микробы сбраживают моно — и дисахара. Лучше всего молочнокислые микробы развиваются в нейтральной среде, но т. к. при  своем развитии значительно подкисляют питательную среду, то приспособились к существованию в зоне довольно низких рН. Критическое значение рН для молочнокислых микроорганизмов 3,5 — 4,0 (наиболее кислотоустойчивые палочковидные микробы). Молочнокислые микроорганизмы широко распространены в природе. Они всегда имеются в почве, на поверхности растений, в молочных и других продуктах, в кишечнике человека и животных. Велико и их практическое значение. Вызываемый ими процесс молочнокислого брожения широко используется в изготовлении молочных продуктов, в хлебопечении, в процессах квашения овощей и силосовании кормов для скота, при изготовлении кваса и обработке меховых шкурок, в производстве молочной кислоты и т. д.  

Ход работы

Постановка опыта:

Для изучения молочнокислого брожения лучше всего в качестве питательной среды взять молоко. Свежее, некипяченое молоко разливают в пробирки, наполняя их на 2/3 объема, закрывают ватными пробками и помещают в термостат с температурой 30 — 35°С на несколько часов. Можно воспользоваться готовыми молочнокислыми продуктами (простокваша, кефир) и рассолом квашеной капусты и огурцов.  

Результаты опыта:

• Микроскопирование молочнокислых микроорганизмов

Из указанных продуктов делают фиксированные мазки, окрашивают их простым способом (лучше метиленовой синью) и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива. На препаратах из прокисшего молока чаще всего встречаются микроорганизмы — возбудители естественного скисания молока — Streptococcus lactis, Lactobacterium   bulqaricum; из рассола капусты и огурцов — Lactobacterium сисumeris, L. plantarum. Если на поверхности прокисшего молока или на рассоле появилась белая бархатистая, морщинистая пленка, то в мазке обнаруживается также и молочная плесень (Oidium lactis) — четырехугольные или овальные клетки ее отличаются от молочнокислых микробов большими размерами. Микрокартину молочнокислых микроорганизмов зарисовать в тетрадь и сделать соответствующие выводы, записи.  

1.2.  Определение молочной кислоты (качественные реакции)

Скисшее молоко отфильтровывают через бумажный фильтр. Фильтрат используют для качественных реакций на молочную кислоту.

• Получение уксусного альдегида. Молочная кислота в кислой среде при температуре кипения окисляется KMnO₄ в уксусный альдегид, который с аммиачным раствором серебра дает характерную реакцию «серебряного зеркала».

Реакцию проводят следующим образом. В коническую колбу на 100 мл берут пипеткой 5 мл фильтрата, добавляют 2 мл крепкой серной кислоты (10%) и нагревают при взбалтывании до начала кипения. Затем, продолжая кипячение и помешивание, пипеткой по каплям приливают 5 мл 5% раствора КМnО₄, который обесцвечивается. В этих условиях молочная кислота переходит в уксусный альдегид. Для распознавания уксусного альдегида быстро покрывают горлышко колбы фильтровальной бумагой или часовым стеклом, смоченным аммиачным раствором АgNО₃. Аккуратно, чтобы не разорвать фильтровальную бумагу, прижимают ее к краям горла колбы, продолжая нагревание. Уксусный альдегид улетучивается и, реагируя с аммиачным раствором азотнокислого серебра, вызывает почернение бумаги с серебристой побежалостью — это выделяется металлическое серебро.

• Реакция с тиофеном. К 1 — 2 мл фильтрата в пробирке прибавляют 5 мл крепкой серной кислоты и 0,5 мл насыщенного раствора сернокислой меди. Смесь взбалтывают, нагревают 5 минут на водяной бане при 100°С и после охлаждения добавляют несколько капель 0,2% спиртового раствора тиофена. В присутствии молочной кислоты получается вишнево- красное окрашивание.

В тетради отметить результаты проведения качественных реакций на молочную кислоту.  

2.  Спиртовое брожение

  Материалы и оборудование. Колбы, глюкоза, пекарские дрожжи, стаканы, пробки и изогнутые стеклянные трубки, пробирки, водяная баня, электрическая плитка, Ва(ОН)₂, кристаллический йод, 10% едкий натр, бихромат калия (K₂Cr₂О₇ ).   Спиртовое брожение — это микробиологический процесс превращения углеводов до этилового спирта и углекислого газа. Кроме того, при спиртовом брожении образуются так называемые сивушные масла — амиловый, изоамиловый, бутиловый, изобутиловый и другие спирты, являющиеся побочными продуктами при обмене аминокислот — изолейцина, лейцина и валина, а также небольшое количество некоторых промежуточных продуктов (глицерин, уксусный альдегид и др.). Возбудителями спиртового брожения являются: некоторые дрожжи, главным образом из рода Saccharomyces (культурные дрожжи — S.cerevisiae, S.globosus, S.vini, S.еllepsoideus и др.), а также некоторые бактерии (Zymomonas mobilis, Sarcina и др.), и плесневые грибы рода Mucor. Дикие дрожжи (Тоrula, Mycoderma) вовсе не обладают бродильными свойствами или они слабо выражены. Дрожжи спиртового брожения делят на расы верхового и низового брожения (верховые и низовые). Верховые дрожжи развиваются при доступе кислорода, брожение идет при температуре 20 — 24°С, сопровождается обильным выделением углекислого газа и образованием пены, дрожжевые клетки при этом выносятся на поверхность среды. Верховые дрожжи чаще всего Saccharomyces cerevisiae используют в спиртовой промышленности, хлебопечении и т. д. Низовые дрожжи (S.vini, S.еllepsoideus) осуществляют брожение при температуре 4 — 10°С. Этот процесс протекает спокойнее и медленнее при образовании компактного осадка дрожжей. Низовое брожение применяется в пивоварении и виноделии. Обычно спиртовое брожение ведут в кислой среде при рН 4,0 — 4,5 (если рН около 8, то одним из основных продуктов брожения будет глицерин) и концентрации сахара 10 – 15% (повышение содержания сахара затрудняет брожение, а при 30 — 35% оно полностью прекращается).  

Ход работы

Постановка опыта:

Для изучения спиртового брожения пользуются синтетической средой следующего состава (в объемных процентах): сахароза — 15,0, пептон — 0,5; КН₂Р0₄ — 0,3; МgSO₄ — 0,1; однако можно с успехом пользоваться 10% раствором сахара в воде при рН 4,5 — 5,0. В колбу емкостью 200 мл наливают 50 мл среды, в нее вносят 0,5 г измельченных пекарских дрожжей. Колбу хорошо встряхивают и закрывают резиновой пробкой со вставленной в нее изогнутой газоотводной трубкой. Свободный изогнутый конец трубки опускают в стакан с водой и надевают на него пробирку, заполненную водой. Смонтированный таким образом прибор помещают в термостат с температурой 35 — 37° С на несколько часов.   В результате жизнедеятельности дрожжей начинает выделяться из колбы углекислый газ, который выходит через отводную трубку и собирается в пробирке. В бродящей жидкости накапливается спирт.  

Результаты опыта:

• Определение СО₂ (качественная реакция)

Наличие углекислого газа в пробирке устанавливают по реакции образования карбоната бария (BaCO₃). Для этого в пробирку, где определяется наличие углекислого газа, приливают немного (1 — 2 мл) баритовой воды (Ва(ОН)₂). В присутствии углекислого газа выпадает белый осадок карбоната бария. СО₂ + Ва(ОН)₂ = ВаСО₃↓ + Н₂О  

2.2.  Определение этилового спирта (качественные реакции)

• Реакция получения йодоформа. Берут из колбы 5 мл бродящей жидкости (отфильтрованной), подщелачивают 10% раствором щелочи (NaOH или KOH), проверив реакцию по лакмусу, нагревают до 60°С и добавляют 1- 2 кристаллика (около 0,1 г) кристаллического йода. Пробирку продолжают нагревать до полного растворения йода.

При наличии в среде этилового спирта в присутствии щелочи происходит образование йодоформа, определяемого по характерному запаху или выпадению желтого осадка.

• Реакция с двухромовокислым калием. Берут 5 мл испытуемой бродящей жидкости, добавляют кристаллик бихромата калия и несколько капель концентрированной серной кислоты. Пробирку с этой смесью нагревают на спиртовке. Цвет жидкости в случае, если в ней есть спирт, изменится до зеленого вследствие восстановления хрома. Выделяющийся уксусный альдегид ощутим по запаху.

ЗС₂Н₅ОН + К₂Cr₂O₇ + 4H₂SO₄ → К₂Cr₂(SO₄) ₄ + 3СН₃СОН + 7Н₂О желтый                                    зеленый               запах цвет                                          цвет                    уксусного альдегида  

2.3.  Микроскопирование дрожжей

Познакомиться с морфологией дрожжей можно при исследовании препарата, приготовленного из бродящей жидкости. Для этого наносят каплю культуральной жидкости на предметное стекло, подкрашивают метиленовой синью закрывают покровным стеклом и микроскопируют с иммерсионной системой объектива, конденсор следует немного опустить. Микрокартину дрожжей следует зарисовать в тетрадь. Если исследуемую каплю подкрасить метиленовой синью, то можно произвести определение состояния живых клеток и вычислить процент мертвых клеток. После подкрашивания мертвые клетки окрашиваются в синий цвет, а живые клетки остаются неокрашенными. Подсчитывают число окрашенных и неокрашенных клеток не менее чем в пяти полях зрения и вычисляют, какой процент они составляют.  

3.  Маслянокислое брожение

  Материалы и оборудование. Пробирки, водяная баня, электроплитка, клубень картофеля, мел, раствор Люголя, микроскоп и все необходимое для приготовления препаратов, 5% раствор FeCl₃, 96% этиловый спирт, крепкая серная кислота, спиртовки.   Маслянокислое брожение — сложный процесс превращения углеводов в анаэробных условиях, когда наряду с масляной кислотой образуются другие продукты (уксусная, пропионовая, капроновая, муравьиная и др. кислоты; этиловый, бутиловый, амиловый и пропиловый спирты, водород и углекислый газ). Возбудители маслянокислого брожения — большая группа спороносных крупных палочек (длина 4 — 12 мкм, ширина 0,5 — 1,5 мкм), относящихся к роду Clostridium. Маслянокислые микроорганизмы способны сбраживать не только простые сахара, но и более сложные углеводы: декстрины, крахмал; пектиновые вещества, глицерин, маннит, органические кислоты и их соли. Характерная особенность маслянокислых микробов — способность накапливать в клетках гранулезу (с йодом дает бурую или синюю окраску). Встречаются маслянокислые микробы в почве, в илистых отложениях озер и прудов, в растительных останках, в навозе, молоке, на поверхности растений. В природе это брожение имеет большое значение как звено в цепи превращений веществ, кроме того, масляная кислота в небольших концентрациях является стимулятором роста растений. Хозяйственной деятельности человека маслянокислые микробы приносят вред, вызывая порчу картофеля и овощей, вспучивание сыров, прогоркание молока и молочных продуктов, порчу консервов и силоса. Типичными представителями маслянокислых микроорганизмов, являются: Clostridium butyricum — в молодой культуре крупная подвижная палочка. Позднее она образует спору и приобретает веретенообразную форму. Накапливает гранулезу. Clostridium pasteurianum — в молодой культуре палочки с закругленными или слегка заостренными концами. Подвижные, расположены одиночно или парами. В старых культурах в клетках, ближе к одному из концов, образуется спора. Этот конец утолщается, и палочка принимает вид сигары или веретена с одним более острым концом. Накапливает гранулезу. Этот микроб активно фиксирует азот атмосферы. Clostridium felsineum — в молодой культуре имеют вид небольших палочек. При спорообразовании клетки утолщаются с одного конца и принимают грушевидную форму. Накапливает много гранулезы.  

Ход работы

Хорошее развитие типичных форм маслянокислых микробов удается получить на среде с картофелем.  

Постановка опыта:

Сырой неочищенный картофель нарезают мелкими кубиками, заполняют ими на 1/3 высокой пробирки, добавляют немного мела (для нейтрализации масляной кислоты), заливают водопроводной водой на 2/3 и помещают в водяную баню при температуре 80°С на 15 — 20 мин (для пастеризации). В среду не вносят ни почву, ни маслянокислые микробы, так как на кожуре картофеля всегда есть их споры. Пробирки плотно закрывают и помещают в термостат. Через 2 — 5 суток картофель всплывает вследствие бурно идущего газообразования. Культуральную жидкость используют для исследования морфологии маслянокислых микробов и качественного определения продуктов брожения.  

Результаты опыта:

• Микроскопирование маслянокислых микроорганизмов

Изучение маслянокислых микробов проводят в «раздавленной» капле. Для этого каплю сброженной жидкости (лучше из среднего слоя) наносят на предметное стекло, добавляют каплю раствора Люголя и покрывают покровным стеклом. Микроскопируют с иммерсионным объективом. При микроскопировании обычно обнаруживают микробов: Clostridium pasteurianum, Clostridium butyricum, Clostridium felsineum. Обращают внимание на образовавшиеся у этих микробов споры, тельца, сильно преломляющие свет, и на клетки, содержащие гранулезу, поэтому окрашенные в синий цвет. Зарисовать микроорганизмы, относящиеся к группе маслянокислых.  

3.2.  Определение масляной кислоты (качественные реакции)

• Получение маслянокислого железа. В пробирку наливают 3 — 5 мл сброженной жидкости, добавляют 1 — 2 мл 5% раствора хлорного железа

(III) и нагревают на спиртовке. Раствор маслянокислого железа в отраженном свете приобретает буровато-коричневое окрашивание, а в проходящем свете — кроваво-красное. Реакция идет по уравнению: 3Ca(СН₃СН₂СН₂СОО)₂ + 2FeСl₃ = 2 Fe(СН₃СН₂СН₂СОО)₃ + 3СаСl₂ маслянокислое железо (бурый цвет)  

• Получение масляно-этилового эфира. К 3 — 5 мл cброженной жидкости в пробирке прибавляют 0,5 мл 96% этилового спирта и 1 — 2 мл крепкой серной кислоты. При взбалтывании и нагревании появляется характерный запах масляно-этилового эфира (запах ананаса).

Реакция протекает по уравнению:   3Ca(СН₃СН₂СН₂СОО)₂ + 2СН₃СН₂ОН = 2СН₃СН₂СН₂СООСН₂СН₃ + Ca(ОН)₂ масляно-этиловый эфир Кроме того, если в накопительной культуре содержится значительное количество масляной кислоты, то ее легко различить по запаху прогоркшего масла. Результаты качественных реакций на масляную кислоту отразить в тетрадях.   УЧАСТИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В КРУГОВОРОТЕ АЗОТА   Азот — важнейший органогенный элемент, входящий в состав белковых веществ любого живого существа. Источником азота для всех форм жизни является минеральный азот. Однако животные для синтеза специфических белковых веществ используют содержащие азот комплексные соединения, входящие в состав растений. С точки зрения «азотного питания» животных мир находится в полной зависимости от растительного мира. Растения синтезируют протеиновые вещества только из запасов минеральных и азотистых веществ почвы. Связанный азот органических соединений так же, как и молекулярный азот атмосферы, большинством зеленых растений не усваивается. Для их развития необходимы минеральные формы азота в виде нитратов. Процесс минерализации органических азотсодержащих веществ проходит через сложный цикл последовательных превращений, включая процессы аммонификации белковых веществ, нитрификации, денитрификации и фиксации молекулярного азота. Во всех этих процессах деятельное участие принимают различные физиологические группы микроорганизмов.  

1.  Аммонификация белка

  Материалы и оборудование. МПБ, почва, полоски лакмусовой и фильтровальной бумаги, раствор щавелевой кислоты, раствор уксуснокислого свинца, фарфоровые чашки, раствор Несслера, микроскоп и все необходимое для приготовления окрашенных препаратов, пипетки.   Аммонификация — это процесс разложения органических азотсодержащих веществ с выделением аммиака. Аммонификация белка начинается с гидролиза белка под влиянием протеолитических ферментов, выделяемых микроорганизмами, с образованием аминокислот. Далее аминокислоты путем дезаминирования разрушаются с образованием аммиака и разнообразных органических соединений в соответствии с характером аминокислот и окружающих условий среды.   Основными конечными продуктами аэробной минерализации белка являются аммиак; углекислый газ, вода, соли серной и фосфорной кислот. В анаэробных условиях при разрушении белка, помимо аммиака и углекислого газа, накапливаются различные органические соединения — кислоты, спирты, сероводород и его производные — меркаптаны, токсические соединения: кадаверин, путресцин, агматин, обладающие неприятным запахом: индол, скатол, образующиеся при распаде триптофана. Скорость минерализации азотсодержащих веществ зависит от соотношения углерода и азота в веществах, подвергающихся разложению (в белке С : N = 3,5:1); температуры (opt. 25 — 30°С); влажности; рН; аэрации и др. Микроорганизмы, вызывающие процесс аммонификации — аммонификаторы широко распространены в природе. Они встречаются в почве, воде, воздухе, кишечнике человека и животных. К числу аммонификаторов относят: аэробные, факультативно — анаэробные и анаэробные микробы.

Аэробные микробы:

Bacillus mycoides (грибовидная бацилла) — палочка, одиночная или соединенная в цепочки, размером 5 — 10 мкм. Споры овальные, расположены на одном конце. Грамположительная. Подвижная, перитрих. На МПА колонии плоские, ризоидные, стелющиеся по поверхности arapa. На МПБ рост в виде куска ваты на дне пробирки. Bacillus subtilis (сенная палочка) — подвижная палочка, одиночная или соединенная в длинные цепочки. Размер 3 — 5 мкм. Споры овальные, расположенные в центре микробной клетки. Г⁺. На МПА колонии складчатые и гладкие, непрозрачные, слизистой консистенции, некоторые окрашены в розовый цвет. На МПБ рост поверхностный в виде пленки. Bacillus mesentericus (картофельная бацилла) — подвижная палочка размером 3 — 10 мкм, часто соединенная в цепочки. Споры овальные, расположенные в любой части клетки. Г⁺. Колонии на МПА тонкие, сухие, морщинистые, не срастаются с субстратом. На МПБ рост поверхностный в виде сухой складчатой пленки. Bacillus megaterium (капустная бацилла) — крупные клетки, размером 6 — 8 мкм, которые часто располагаются цепочкой. Г⁺. На МПА образует гладкие, жирноблестящие колонии. Края колоний локонообразные. На МПБ образует слабую муть. Serratia marcescens (чудесная палочка) — мелкая, размером 0,6 — 1,0 мкм, подвижная, не образует спор, грамотрицательная. На МПА колонии круглые, приподнятые в центре, красного цвета, блестящие, слизистой консистенции. Края колонии ровные. На МПБ интенсивная муть красного цвета. Pseudomonas fluorescens — небольшая, подвижная палочка размером 1 — 2 мкм, культура образует зеленовато — желтый флюоресцирующий пигмент. На МПА колонии часто бесцветные, выпуклые, блестящие.

Факультативные анаэробы:

Proteus vulgaris — в молодых культурах мелкие (1,6 — 4 мкм), бесспоровые, подвижные, сильно полиморфные палочки, позднее   появляются нитевидные формы длиной 10 — 20 мкм. На МПА колонии стелются по поверхности агара тонким едва заметным налетом, края колоний извилистые. На МПБ рост культуры в виде равномерной мути. Escherichia coli (кишечная палочка) — клетки имеют форму короткой, толстой (2 — 4 ´ 0,5 мкм) с закругленными концами палочки. Подвижная. Спор и капсул не образует. Грамотрицательная. На МПА колонии круглые, прозрачные с голубоватым оттенком. На МПБ равномерная серая муть. На дифференциально-диагностических средах (Эндо, Левина, Плоскирева) образует окрашенные колонии.

Анаэробные микробы:

Clostridium putrificum (гнилостная палочка) — небольшая (5,6 ´ 0,8 мкм) подвижная, спорообразующая палочка. Споры располагаются на одном из ее концов, вызывая утолщение в виде барабанной палочки. Чаще встречаются одиночные клетки. Г⁺. На МПА растет в глубине среды в виде рыхлых хлопьевидных колоний. Разлагает белки в строго анаэробных условиях с выделением большого количества газов. Clostridium sporogenes (спорогенная палочка) — подвижная размером 5 — 6 мкм. Образует овальную спору, которая чаще располагается в центре клетки, и она приобретает веретенообразную форму. Грамположительная. На МПА образует круглые, вязкие, непрозрачные колонии.  

Ход работы

Для изучения аммонификации белковых веществ в качестве питательных сред чаще всего пользуются мясопептонным бульоном (МПБ), мясопептонным агаром (МПА) или мясопептонным желатином (МПЖ).  

Постановка опыта:

30 мл мясопептонного бульона наливают в колбу на 100 мл и добавляют 1/2 чайной ложки почвы. Колбу закрывают ватной пробкой. Над средой подвешивают три бумажки — красную лакмусовую бумажку для обнаружения выделяющегося аммиака; фильтровальную, смоченную 10% раствором уксуснокислого свинца, для обнаружения сероводорода; и еще одну фильтровальную, смоченную горячим насыщенным (12%) водным раствором щавелевой кислоты и высушенной в термостате, для обнаружения выделяющегося индола. Бумажки не должны касаться среды. Приготовленные таким образом колбы ставят в термостат при температуре 28 — 30°C на 3 — 5 суток.  

Результаты опыта:

• Качественные реакции на продукты гнилостного распада белка
  • Проба на аммиак (NН₃) а) выделяющийся аммиак окрашивает подвешенную красную лакмусовую бумажку в синий цвет;

б) в фарфоровую чашку пипеткой вносят каплю бульонной культуры микробов и каплю реактива Несслера, смешивают. При наличии большого   количества аммиака, культура с индикатором приобретает бурое или коричневое окрашивание, при небольшом — оранжевое или желтое.

• Проба на сероводород (H₂S) (конечный продукт распада серосодержащих аминокислот: цистина, цистеина, метионина). Подвешенная над культурой полоска фильтровальной бумаги, смоченная уксуснокислым свинцом в присутствии сероводорода чернеет (происходит образование сернистого свинца — PbS).
• Проба на метилмеркаптан (СН₃SH). Если почерневшая фильтровальная бумажка (см. предыдущий опыт) покрывается серебристым налетом, значит, наряду с сероводородом выделяются еще меркаптаны (например, метилмеркаптан).
• Проба на индол (продукт распада аминокислоты триптофана)

1. a) определение индола по методу Мореллы — с помощью фильтровальной бумаги, смоченной горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты. При наличии индола нижняя часть индикаторной бумаги розовеет;

б) для выявления индола можно пользоваться реакцией Сальковского: к 10 мл субстрата добавляют 1 мл 0,2% KNO₂ и несколько капель крепкой серной кислоты. При взаимодействии этих веществ с индолом получается красно-фиолетовое окрашивание.  

1.2.  Микроскопирование микроорганизмов – аммонификаторов

Для изучения морфологии аммонификаторов из нижних слоев накопительной культуры готовят фиксированный мазок и окрашивают его простым способом (фуксином или метиленовой синью) или по Граму. Микроскопируют, используя иммерсионный объектив. На препаратах чаще всего встречаются микробы: Proteus vulgaris, Bacillus mycoides, Clostridium putrificum, C. sporogenes. В тетрадях отметить результаты качественных реакций и зарисовать возбудителей гнилостного распада белков.  

2.  Нитрификация

  Материалы и оборудование. Среда Виноградского, колбы на 150 — 200 миллилитров, почва, раствор Несслера, реактив цинк – йод — крахмал, 20% раствор серной кислоты, дифениламин в серной кислоте, хлорид аммония (NH₄C1), 30% уксусная кислота, все необходимое для приготовления и окраски мазков, фарфоровые чашки, спиртовки, спички, микроскопы.   Нитрификация — это окисление аммиака с образованием азотистой и азотной кислот (или их солей нитритов и нитратов). Процесс нитрификации аммиака происходит в две фазы при участии двух групп микробов. В   первую   фазу   аммиак   окисляется   до   солей   азотистой   кислоты (нитритов).   В   этом   процессе   участвуют   нитрозные   микроорганизмы,   относящиеся к родам: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosospira, Nitrosolobus, Nitrosococcus. Nitrosomonas europea — овальный кокк диаметром 1,5 — 3 мкм с одним длинным жгутиком. Спор не образует. Nitrosocystis — кокки диаметром 1,5 мкм, образуют скопления, окруженные общей слизистой капсулой. Nitrosospira — клетки спиралевидной формы длиной до 15 — 20 мкм. Встречаются и очень мелкие кокковидные организмы. Наиболее изучен вид Nitrosomonas europae, характерный для почв Европы. Во вторую фазу нитрификации соли азотистой кислоты окисляются в соли азотной кислоты (нитраты). В этом процесс участвуют нитратные микробы, относящиеся к роду Nitrobacter. Это мелкие, округлые, яйцевидные или грушевидные клетки размером до 1,5 мкм. Известно чередование в цикле развития подвижной и неподвижной стадий. Грамотрицательные. Среди микробов этого рода различают два вида Nitrobacter winogradsky  и Nitrobacter agilis. Нитрифицирующие микроорганизмы строго специфичны в отношении окисляемого вещества. Они типичные хемолитоавтотрофы, облигатные аэробы. Благодаря деятельности нитрифицирующих микробов огромные массы газообразного аммиака, образуемого в процессе аммонификации, фиксируются в почве и переводятся в нитраты, являющиеся лучшим источником азотного питания для растений.  

Ход работы

Постановка опыта:

Накопительную культуру нитрифицирующих микробов можно поставить путем приготовления питательной смеси (среда Виноградского). Ее состав следующий:

Вода водопроводная	— 1000 мл
Сульфат аммония (NН4)2SO4	— 2,0 г
Фосфат калия (К2HPO4)	— 1,0 г
Сульфат магния (MgSO2)	— 0,5 г
Хлорид натрия (NaC1)	— 2,0 г
Сульфат железа (FeSO4)	— 0,4 г
Карбонат кальция (или магния) (СаСО3)	— 1,0 г

  Приготовленную среду наливают в конические колбочки емкостью 150 — 200 мл тонким слоем (0,5 — 1,0 см) и стерилизуют. При разливке среду необходимо хорошо встряхнуть, т. к. в ней образуется осадок фосфорнокислого железа. В простерилизованную среду вносят землю (около 0,5 г на колбу) и помещают в термостат с температурой 25 — 30°С. Через 12 — 14 дней на поверхности жидкости образуется легкая пленка, состоящая из нитрозных микробов, а в среде исчезает аммиак и появляются сначала нитриты а затем нитраты.  

Результаты опыта:

О ходе процесса нитрификации судят по изменению состава питательной среды в колбах.

2.1.  Качественная реакция на аммиак

Наличие аммиака проверяют реактивом Несслера (работа 1.1.1 б).

• Качественная реакция на нитриты (с реактивом цинк — йод — крахмал)

В фарфоровую чашку капают 1 каплю 20% раствора серной кислоты и добавляют к ней три капли реактива цинк — йод — крахмал. К смеси добавляют 1 каплю исследуемой питательной среды. В присутствии нитритов смесь окрашивается в синий цвет.

• Качественная реакция на нитраты (с дифениламином)

В фарфоровую чашку помещают несколько капель питательной среды  из колбы и прибавляют каплю реактива дифениламина, растворенного в серной кислоте. В присутствии нитратов жидкость приобретает синюю окраску. Следует иметь в виду, что азотистая кислота (нитриты) с дифениламином также дают синее окрашивание, поэтому для определения нитратов в среде необходимо разрушить содержащиеся в ней нитриты. Для этого среду кипятят с NH₄C1 в присутствии 30% уксусной кислоты. После кипячения проводят реакцию с дифениламином.  

2.4.  Микроскопирование нитрифицирующих микроорганизмов

Для изучения морфологии нитрифицирующих микроорганизмов из питательной среды в колбах готовят фиксированные мазки, окрашенные фуксином или препарат «раздавленная капля». Микроскопируют, пользуясь иммерсионным объективом. В поле зрения микроскопа обычно видны кокковидные клетки Nitrosomonas и короткие палочковидные клетки Nitrobacter. В тетрадях зарисовать нитрифицирующих микробов и отметить результаты качественных реакций на нитриты и нитраты.  

3.  Денитрификация

  Материалы и оборудование. Сахароза, натрий азотнокислый, калий кислый фосфорнокислый, высокие колбы с резиновыми пробками, почва, дифениламин в серной кислоте, цинк-йод — крахмал, 20% раствор серной кислоты, раствор Несслера, фарфоровые чашки, все необходимое для приготовления мазков, спиртовки, микроскопы.   Процесс восстановления нитратов через стадию нитритов до аммиака и молекулярного азота, который ведут микроорганизмы, называется прямой денитрификацией. К наиболее активным денитрификаторам относятся:   Pseudomonas pyoceunea — мелкие палочки, размером 1,0 — 1,5 мкм, бесспоровые, грамотрицательные, подвижные. Культура образует пигмент, окрашивающий среду в сине-зеленый цвет. Лучше развиваются в аэробных условиях. Pseudomonas fluorescens — мелкие палочки, размером 1,0 — 20 мкм, бесспоровые, подвижные, Г^—, образуют пигмент и окрашивают среду в зеленовато — желтый цвет. Achromobacter stutzeri — небольшие, подвижные грамотрицательные палочки (0,3 ´ 0,5 мкм), соединенные в цепочки. Восстанавливают нитраты в анаэробных условиях. Pseudomonas denitrificans — маленькие перитрихиальные жгутиковые, бесспоровые палочки; факультативный анаэроб. Thiobacillus denitrificans — представитель серобактерий. Xeмолитоавтотрофы. Небольшие (1 — 3 мкм) подвижные, бесспоровые, грамотрицательные палочки. Все микроорганизмы — денитрификаторы широко распространены в почве и воде и активно восстанавливают нитраты при плохой аэрации и высокой влажности почвы.  

Ход работы

Постановка опыта:

Для получения накопительной культуры денитрифицирующих микробов готовят минеральную питательную среду, следующего состава при рН 7,0: Вода водопроводная                                           — 100 мл Сахароза (С₁₂Н₂₂О₁₁)                                           — 2,0 г Нитрат натрия (NaNO₃)                                       — 0,2 г Фосфат калия (К₂НРО₄)                                       — 0,05 г   Приготовленной питательной средой наполняют высокие колбы, стерилизуют. Для заражения денитрифицирующими микробами в среду вносят 0,5 г почвы, взятой с необрабатываемого сильно увлажненного земельного участка. Колбу закрывают резиновой пробкой и помещают в термостат с температурой 35°С на 2 — 3 недели. О готовности накопительной культуры можно судить по выделению пузырьков газа со дна жидкости и по редукции нитратов в ней.  

Результаты опыта:

Для определения продуктов жизнедеятельности денитрифицирующих микробов из культуральной жидкости делают пробы на нитраты, нитриты и аммиак.

• Качественная реакция на нитраты с дифениламином (см. работы

2.3.)

• Качественная реакция на нитриты с цинк – йод — крахмал (см.

работу 2.2.)  

• Качественная реакция на аммиак с реактивом Несслера (см. работу 1.1б).

Обычно на 6 – 7-е сутки культивирования пробы на нитраты и нитриты дают отрицательную реакцию, а проба на аммиак положительная, что свидетельствует о восстановлении нитратов до аммиака.  

3.4.  Микроскопирование денитрифицирующих микроорганизмов

Для знакомства с возбудителями денитрификации из середины субстрата пипеткой берут и готовят фиксированный и окрашенный препарат. Мазок также можно приготовить из осадка. Микроскопирование проводят с использованием иммерсионного объектива. В поле зрения микроскопа видны мелкие палочковидные, неспорообразующие, располагающиеся одиночно, скоплениями либо в виде коротких цепочек клетки денитрифицирующих микроорганизмов. В тетрадях отразить результаты качественных реакций и зарисовать микроорганизмы – денитрификаторы.

4. Фиксация микроорганизмами молекулярного азота Материалы и оборудование. Корни люпина, реактивы для

приготовления питательной среды Эшби, колбы на 100 — 150 мл, почва, все необходимое для приготовления препаратов, микроскопы, раствор Люголя, скальпель, пинцет. Азотфиксирующие микроорганизмы способны усваивать молекулярный азот воздуха и строить из него разнообразные азотсодержащие органические соединения своей клетки. Эти микроорганизмы свободно живут в почве или находятся в симбиозе с растениями.  

4.1.  Свободноживущие в почве азотфиксаторы

К свободноживущим в почве микроорганизмам, способным фиксировать молекулярный азот атмосферы, относят микробов рода Azotobacter, Сiostridium, Beijerinkia, некоторые спириллы, дрожжи, сине-зеленые водоросли. Наиболее активными являются: Azotobacter chroococcum — это подвижные клетки, Г^—, размером 3 — 7 мкм, в молодых культурах палочковидные с возрастом приобретают шаровидную форму. Клетки соединены парами или в сарциноподобные пакеты, обычно окружены слизистой капсулой. В цитоплазме много блестящих зерен волютина. Колонии на плотных питательных средах слизистые, растекающиеся или выпуклые, бесцветные или окрашенные в темно- коричневый до черного цвет. На 1 г потребляемого углевода усваивает до 20 мг атмосферного азота. Azotobacter agile — шаровидные или слегка овальные (3 — 5 мкм), Г^—, очень подвижные клетки, соединенные чаще парами. Вокруг клеток имеется тонкий ободок слизистой капсулы; выделяет в среду желтый или   зеленоватый пигмент. Колонии гладкие, влажно-блестящие. Связывает 15 мг азота на 1 г углевода. Azotobacter vinelandii в молодой культуре мелкие (0,8 ´ 2,5 мкм), подвижные, Г^—, перетрихиально — жгутиковые палочки. С возрастом клетки укорачиваются и приобретают шаровидную форму. Колонии гладкие, блестящие или слизистые, прозрачные. Микроб выделяет сине-зеленый флюоресцирующий пигмент. Связывает около 15 мг азота на 1 г сахара. Все перечисленные и другие виды азотобактера относятся к аэробным микроорганизмам, и лучше всего развиваются при свободном доступе воздуха. Грамотрицательные. Оптимум рН лежит в пределах 7,2 — 8,0. В анаэробных условиях на тяжелых кислых почвах фиксацию молекулярного азота ведут микробы Clostridium pasteurianum. Это палочковидные подвижные клетки размером 3 — 7 мкм, одиночные или расположенные парами и короткими цепочками. Споры овальные, формируются центрально, при этом клетки — спороносцы принимают форму веретена или лимона. В клетках накапливается много гранулезы. Колонии беловатые, гладкие, блестящие. Азотфиксирующая активность составляет 10

• 12 мг на 1 г потребляемого углевода.

Ход работы

Постановка опыта:

Для накопления свободноживущих азотфиксаторов используют среду Эшби, не содержащую солей азота. Состав питательной среды (в граммах на 1 л дистиллированной воды) следующий:

Маннит, или глюкоза, или сахароза	— 20,0
Фосфат калия (К2НРО4)	— 0,2
Сульфат магния (MgSO4)	— 0,2
Хлорид натрия (NaC1)	— 0,2
Сульфат калия (К2SO4)	— 0,1
Сульфат железа (FeSO4)	— 2 капли 1% раствора
Мел	— 5,0

Приготовленную питательную среду разливают по колбам емкостью 100

• 150 мл слоем в 1 — 1,5 см и заражают почвой (1/2 чайной ложки). Колбы закрывают ватным тампоном или ватными пробками и помещают в термостат при температуре 28 — 30°С на 10 — 14 дней.

 

Результаты опыта:

Через 5 — 7 дней на поверхности питательной среды и на стенках колбы появляется быстро буреющая пленка, содержащая Azotobacter chroococcum, а на дне жидкости, которая к этому времени слегка мутнеет, пенится и издает запах масляной кислоты, скапливается Clostridium pasteurianum. Для изучения морфологии микроорганизмов готовят два препарата:  один — из пленки на поверхности среды, помещенной в каплю стерильной воды (препарат «раздавленная» капля), или готовится фиксированный мазок, окрашенный простым способом; второй — препарат прижизненный, готовят   его из нижних слоев жидкости в колбе, с добавлением раствора Люголя (реактив на гранулезу). Препараты микроскопируют, пользуясь иммерсионным объективом. В первом препарате находят крупные круглые или овальные клетки Azotobacter chroococcum, покрытые толстой слизистой капсулой. Во втором препарате находят веретенообразные, с продолговатой спорой в центре клетки Clostridium pasteurianum. В тетради делают зарисовки.  

4.2.  Симбиотические азотфиксаторы

Азотфиксирующие микроорганизмы, которые живут в симбиозе с корнями бобовых растений и образуют на их корнях клубеньки, называют клубеньковыми бактериями. Клубеньковые бактерии относятся к роду Rhizobium. Форма и величина клубеньковых бактерий изменяется в зависимости от стадии их развития. В молодой культуре они представлены короткими подвижными палочками, со временем они утрачивают подвижность и переходят в стадию так называемых опоясанных палочек. При окраске анилиновыми красителями ярко окрашенные участки цитоплазмы чередуются со светлыми полями, в которых концентрируются жировые включения, не воспринимающие окраску. При старении культуры опоясанные палочки переходят в стадию бактероидов, клетки ветвятся, принимая причудливую форму кораллов. Стадии опоясанных палочек и бактероидов обычно совпадают с фазой бутонизации и цветения бобовых растений и характеризуются максимальной интенсивностью фиксации азота. Клубеньковые бактерии обладают избирательной способностью вступать в симбиотические взаимоотношения с различными бобовыми растениями. На основании специфичности симбиоза все клубеньковые бактерии делят на виды: бактерии гороха, вики, чины — Rhizobium leguminosarum; донника и люцерны — Rhizobium meliloti; клевера — Rhizobium trifolii; фасоли — Rhizobium phaseoli; люпина — Rhizobium lupini; сои — Rhizobium japonicum и др. Все клубеньковые бактерии грамотрицательные. Отдельные виды имеют некоторые разнообразия морфологических форм. Так, Rhizobium trifolii — толстые и короткие (до 2 мкм), покрытые слизью палочки; у Rhizobium leguminosarum длина палочек достигает 3,5 — 4 мкм; Rhizobium lupini сильно изогнутые, крупные, покрытые слизью палочки. Неодинаковые у бобовых растений и формы, и размеры клубеньков, а также расположение их на корнях. У одних бобовых растений (горох, клевер, вика) клубеньки образуются в виде небольших вздутий на различных разветвлениях корней; у других (люпина) они имеют вид крупных бородавчатых наростов на главном корне. Клубеньковые бактерии имеют очень большое сельскохозяйственное значение, так как, усваивая азот из воздуха, они способствуют повышению урожайности сельскохозяйственных и особенно бобовых культур.  

Ход работы

4.2.1. Форма и строение клубеньков бобовых

На фиксированном материале рассматривают клубеньки на корнях разных бобовых растений (горох, фасоль, клевер, люпин), отмечают формы, размеры, расположение на корне и делают зарисовки. Для изучения строения острой бритвой готовят тонкий срез через клубенек. Срез помещают в каплю воды на предметное стекло, подкрашивают фуксином или метиленовым синим и микроскопируют (окуляр ´7, объектив ´40). На препарате хорошо видна бактероидная ткань, меристема и кора клубенька. Зарисовать в тетради.  

4.2.2. Морфология клубеньковых бактерий

Для изучения морфологии клубеньковых бактерий следует приготовить фиксированный окрашенный препарат. Для этого разрезают клубенек и отжимают каплю сока в каплю воды на предметном стекле. Если клубеньки маленькие, их разрушают препаровальными иглами, и полученный материал размазывают по стеклу. Мазки фиксируют и окрашивают простым способом. Микроскопируют препарат, используя иммерсионный объектив. На препаратах видны клубеньковые бактерии разных форм и размеров, мелкие палочки, более крупные опоясанные палочки и бактероиды. Преобладание той или иной формы зависит от возраста клубенька и фазы  развития бобового растения. Различные формы клубеньковых бактерий зарисовать.  

4.2.3. Выделение клубеньковых бактерий в чистую культуру Постановка опыта:

Для выделения клубеньковых бактерий пользуются питательной средой следующего состава: Бобовый бульон (из 10 г гороха)                       — 100 мл Маннит (или сахароза С₁₂ Н₂₂О₁₁)                     — 1 г Фосфат калия (К₂НРО₄)                                      — 0,1 г Агар                                                                     — 1,5 г Приготовленную питательную среду разливают в пробирки, наполняя их на две трети объема, и стерилизуют. Для посева выбирают корень бобового растения с хорошо развитыми клубеньками. Клубеньки срезают и погружают их на 5 минут в 0,1 водный раствор сулемы, промывают дистиллированной водой, выдерживают 1 минуту в 96% спирте и вновь тщательно промывают водой. Обработку клубеньков удобно проводить в маленьких бюксах, тигельных чашках или пенициллиновых флаконах. После обработки наиболее крупный или несколько маленьких клубеньков переносят в фарфоровую чашку в каплю воды и раздавливают их пинцетом. Прокаленной и охлажденной металлической петлей берут кусочек клубенька или его содержимое и вносят в пробирку с расплавленной и   охлажденной до 40°С питательной средой, которую размешивают (вращая пробирку между ладонями), наливают в стерильную чашку Петри ровным слоем. Чашки с посевом помещают в термостат с температурой 25°С. Через несколько дней на поверхности питательной среды развиваются мелкие беловатые студенистые колонии клубеньковых бактерий.

Результаты опыта:

Для изучения морфологии клубеньковых бактерий из их колоний готовят мазки. Мазки фиксируют, окрашивают простым способом и микроскопируют, пользуясь объективом ´90. На мазках отмечают фазу развития клубеньковых бактерий, делают зарисовки.  

Контрольные вопросы

1. Какие различают типы брожений? В чем их сущность?
2. Назовите и    дайте    характеристику    микроорганизмам,   вызывающим молочнокислое, спиртовое, маслянокислое брожения.
3. Питательные среды какого состава применяются для культивирования соответствующих микробов?
4. Каковы условия,   благоприятствующие  протеканию   различных  типов брожения?
5. Укажите значение различных типов брожения в природе и хозяйственной деятельности человека.
6. В чем суть процессов аммонификации белков, мочевины, нуклеиновых кислот?
7. Каковы культуральные и морфологические свойства микроорганизмов- аммонификаторов?
8. Что такое нитрификация? Химизм этого процесса, возбудители, условия и значение.
9. Что такое прямая денитрификация, косвенная денитрификация?
10. В чем заключаются характерные особенности возбудителей денитрификации?
11. Какие качественные реакции используются на продукты жизнедеятельности аммонифицирующих,           нитрифицирующих, денитрифицирующих микроорганизмов.
12. Какие фазы развития клубеньковых бактерий выделяют? 13.Каковы основные свойства клубеньковых бактерий?
13. Как образуются клубеньки на корнях бобовых растений?
14. В чем заключается механизм фиксации азота клубеньковыми бактериями?